本文關鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對順鉑誘導離體小鼠耳蝸細胞凋亡的影響

  更多相關文章： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 順鉑 耳蝸 細胞凋亡 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 肌醇需求酶1

【摘要】：目的研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)對順鉑(cisplatin,CDDP)誘導離體小鼠耳蝸細胞凋亡的影響,探討CDDP誘導耳蝸細胞凋亡的可能機制,為臨床防護CDDP耳毒性聾提供新思路。方法將新生3~5天昆明小鼠耳蝸基底膜分離,置于含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基/F12(Dulbecco's Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F/12,DMEM/F12)中培養(yǎng),24h后棄去原培養(yǎng)基。1.將基底膜隨機分成五組,對照組加入不含CDDP的新鮮培養(yǎng)基2m I,其余四組分別加入含有不同濃度CDDP(4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml和32μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基2ml,繼續(xù)培養(yǎng)24h后終止實驗。應用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的鬼筆環(huán)肽熒光染色方法觀察小鼠耳蝸毛細胞的形態(tài)學變化,耳蝸毛細胞計數(shù)檢測毛細胞缺失率;應用異硫氰酸四甲基羅丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC)標記的鬼筆環(huán)肽與Hoechst33258雙重熒光染色方法觀察小鼠耳蝸毛細胞的凋亡,并檢測毛細胞凋亡率;應用免疫印跡技術(Western blot)檢測ERS標志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein,GRP78)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12,caspase-12)在小鼠耳蝸細胞中的表達;同時應用Western blot技術檢測肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)在小鼠耳蝸細胞中的表達。2.將基底膜隨機分成四組,對照組加入不含CDDP的新鮮培養(yǎng)基2ml,CDDP組加入含有16μg/ml順鉑的新鮮培養(yǎng)基2ml,�；切苋パ跄懰�(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)組加入含有500μg/ml TUDCA的新鮮培養(yǎng)基2ml,CDDP+TUDCA組預先加入含有500μg/ml TUDCA的新鮮培養(yǎng)基2ml,15min后加入16μg/ml順鉑,與其它三組同時培養(yǎng)24h后終止實驗。采用Western blot技術檢測GRP78和caspase-12在小鼠耳蝸細胞中的表達。結(jié)果1.FITC標記的鬼筆環(huán)肽染色顯示為綠色熒光。對照組小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞(inner hair cell,IHC)和外毛細胞(outer hair cell,OHC)著色均勻,纖毛結(jié)構(gòu)完好、排列有序,耳蝸毛細胞計數(shù)結(jié)果顯示IHC與OHC的缺失率均低于1%;CDDP組小鼠耳蝸毛細胞出現(xiàn)纖毛倒伏、缺失、排列紊亂等形態(tài)變化,當CDDP濃度為4μg/ml時,OHC缺失率明顯增大,與對照組比較差異顯著(P0.05),而IHC缺失率無明顯變化(P0.05);并且隨著CDDP濃度的逐漸增高,耳蝸IHC與OHC的缺失率均顯著增大,呈現(xiàn)明顯的量效關系(P0.05,P0.01)。2.Hoechst 33258染色結(jié)果顯示,對照組小鼠耳蝸毛細胞核呈淡藍色,核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻,毛細胞凋亡率低于5%。CDDP組小鼠耳蝸毛細胞核因明顯固縮而呈亮藍色,核內(nèi)染色質(zhì)邊緣化、凝集成塊狀或呈不規(guī)則碎片狀;并且隨著CDDP濃度的逐漸增高,破碎的細胞核顯著增多,毛細胞凋亡率顯著增大,呈現(xiàn)明顯的量效關系(P0.01)。3.Western blot檢測結(jié)果顯示,對照組小鼠耳蝸GRP78和caspase-12的蛋白表達微弱,而CDDP組小鼠耳蝸上述蛋白表達水平均較對照組明顯增高(P0.01),并且隨著CDDP濃度的逐漸增高而顯著增強(P0.01)。加入TUDCA后,小鼠耳蝸中GRP78和caspase-12的蛋白表達水平較CDDP組明顯降低(P0.01)。4.Western blot檢測結(jié)果顯示,對照組小鼠耳蝸IRE1、JNK1、JNK2和Bax的蛋白表達微弱,而CDDP組小鼠耳蝸上述蛋白表達水平均較對照組明顯增高(P0.01),并且隨著CDDP濃度的逐漸增高而顯著增強(P0.01)。結(jié)論ERS相關蛋白GRP78、IRE1、JNK和caspase-12在CDDP干預后離體小鼠耳蝸中的高表達,提示ERS可能參與了CDDP誘導的小鼠耳蝸細胞凋亡,IRE1通路可能是ERS介導順鉑所致離體小鼠耳蝸細胞凋亡的途徑之一。
【關鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 順鉑 耳蝸 細胞凋亡 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 肌醇需求酶1
【學位授予單位】：遼寧醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 中文論著摘要4-7
• 英文論著摘要7-11
• 英文縮略語表11-13
• 前言13-16
• 實驗材料與方法16-21
• 實驗結(jié)果21-30
• 討論30-34
• 結(jié)論34-35
• 本研究創(chuàng)新性的自我評價35-36
• 參考文獻36-39
• 附錄39-53
• 綜述39-50
• 參考文獻47-50
• 在學期間科研成績50-51
• 致謝51-52
• 個人簡介52-53

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本文編號：908649