本文關(guān)鍵詞：STGC3基因高表達(dá)對CNE2細(xì)胞自噬的影響及機(jī)制

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【摘要】：目的:研究STGC3基因高表達(dá),對鼻咽癌CNE2細(xì)胞系自噬的影響,并探討其可能的分子機(jī)制,為進(jìn)一步闡明STGC3基因在鼻咽癌發(fā)病中的作用及分子機(jī)制提供新的實驗依據(jù)。方法:運(yùn)用慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng),建立STGC3基因穩(wěn)定高表達(dá)的CNE2細(xì)胞系,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞紅色熒光蛋白表達(dá),qRT-PCR技術(shù),檢測STGC3 mRNA水平,實驗確定轉(zhuǎn)染效率;qRT-PCR及Western Blot方法,檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I、p62蛋白水平的變化;GFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的形成;Western Blot方法,檢測p-S6、p-ULK1蛋白水平變化。結(jié)果:表達(dá)載體經(jīng)DNA測序鑒定,結(jié)果表明STGC3高表達(dá)慢病毒載體RTP-h STGC3-his成功構(gòu)建;將空載體(RTP-his)和RTP-h STGC3-his分別轉(zhuǎn)染至CNE2細(xì)胞,熒光顯微鏡下可見RFP表達(dá)的紅色熒光,證明RTP-his和RTP-h STGC3-his成功導(dǎo)入CNE2細(xì)胞;qRT-PCR方法,檢測結(jié)果顯示,RTP-h STGC3-his載體轉(zhuǎn)染CNE2,CNE2細(xì)胞系恢復(fù)STGC3基因表達(dá),成功建立STGC3基因穩(wěn)定高表達(dá)的CNE2細(xì)胞(CNE2-RTP-h STGC3-his);CNE2-RTP-h STGC3-his和CNE2-RTP-his細(xì)胞,經(jīng)無糖d-Hanks饑餓處理4h,分為實驗組及陰性對照組,CNE2-RTP-his未經(jīng)饑餓處理作為空白對照組,qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示,陰性對照組CNE2-RTP-his細(xì)胞中LC3mRNA表達(dá)上調(diào),LC3-II/LC3-I比值升高,p62表達(dá)水平降低(P0.01);實驗組CNE2-RTP-h STGC3-his細(xì)胞中LC3 mRNA表達(dá)下調(diào),LC3-II/LC3-I比值降低,p62表達(dá)水平升高(P0.01)。瞬時轉(zhuǎn)染LC3-GFP融合蛋白并予以饑餓處理,共聚焦顯微鏡可見陰性對照組CNE2-RTP-his細(xì)胞中綠色熒光斑點增多,而實驗組CNE2-RTP-h STGC3-his細(xì)胞中綠色熒光斑點減少(P0.01),表明實驗組細(xì)胞自噬體的形成被抑制;Western Blot檢測結(jié)果顯示:饑餓處理,陰性對照組CNE2-RTP-his細(xì)胞中p-S6和p-ULK1表達(dá)下調(diào),而實驗組CNE2-RTP-h STGC3-his細(xì)胞中p-S6和p-ULK1表達(dá)上調(diào)(P0.01)。結(jié)論:1.上調(diào)STGC3基因在CNE2細(xì)胞的表達(dá),可抑制饑餓誘導(dǎo)的CNE2細(xì)胞自噬。2.STGC3基因在CNE2細(xì)胞高表達(dá),可通過激活m TOR通路,抑制饑餓誘導(dǎo)的CNE2細(xì)胞自噬。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 STGC3基因 自噬 mTOR CNE2
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要中英文縮略詞表9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 技術(shù)路線14-16
• 1、構(gòu)建 STGC3 高表達(dá) CNE2 細(xì)胞系14-15
• 2、STGC3 高表達(dá)對 CNE2 細(xì)胞系自噬的影響及其分子機(jī)制15-16
• 第三章 材料與方法16-36
• 3.1 材料16-21
• 3.2 方法21-36
• 第四章 結(jié)果36-50
• 4.1 RTP-h STGC3-his 重組質(zhì)粒的鑒定36-38
• 4.2 慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CNE2 細(xì)胞后的 RFP 表達(dá)情況38-39
• 4.3 qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體后 CNE2 細(xì)胞中 STGC3 的表達(dá)39-42
• 4.4 STGC3 過表達(dá)對饑餓處理的 CNE2 細(xì)胞 LC3 表達(dá)的影響42-44
• 4.5 STGC3 過表達(dá)對饑餓處理的 CNE2 細(xì)胞 p62 表達(dá)的影響44-45
• 4.6 GFP-LC3 融合蛋白檢測 STGC3 高表達(dá)對 CNE2 細(xì)胞自噬的影響45-47
• 4.7 Westernblot 檢測 STGC3 高表達(dá)對 CNE2 細(xì)胞 p-S6 及p-ULK1 表達(dá)的影響47-50
• 第五章 討論50-56
• 第六章 結(jié)論56-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 綜述64-72
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文72-74
• 致謝74

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