本文關鍵詞：TLR2單克隆抗體影響大鼠角膜移植排斥反應的實驗研究

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【摘要】：研究背景角膜移植是機體內移植成功率最高的器官移植之一,而移植后排斥反應是導致角膜移植失敗的最主要原因。研究認為：角膜移植術后免疫排斥反應是一個多成分參與、極為復雜和精細調節(jié)的反應過程。移植后隨著移植抗原的提呈,CD4+T細胞激活,促使Th1分化,分泌IL-2. IFN-y、TNF-a等細胞因子,因此所致的遲發(fā)型超敏反應在角膜移植中起主導作用。Kuffova等認為移植后的免疫反應早期表現(xiàn)為炎癥反應。Holland等也觀察到在角膜排斥的早期存在非特異性的炎癥反應：T細胞和巨噬細胞聚集在切口和縫線的周圍,角膜植片增厚。Holland強調排斥反應的細胞免疫反應不同于同基因移植術后的細胞免疫,術后早期切口和縫線周圍的非特異性炎癥是誘導供體內皮細胞損傷、新生血管生長的重要因素。在炎癥性植床,供體來源地樹突狀細胞移行到宿主的頸部淋巴結激活宿主T細胞,通過直接途徑誘發(fā)排斥反應。角膜移植急性排斥反應的病理變化具有兩個主要特征：角膜基質層的炎性細胞浸潤和新生血管。角膜基質以單核細胞浸潤為主,尚可見漿細胞、淋巴細胞以及中性粒細胞等。炎癥的后果,導致角膜作為免疫特赦區(qū)域的優(yōu)勢完全消失,排斥反應發(fā)生早且嚴重,免疫抑制劑也發(fā)揮不了調控作用。雖然排斥反應是由宿主機體通過抗原提呈細胞激活CD4+T細胞促使,但最新證據(jù)表明先天免疫系統(tǒng)在其中也起著重要作用。TLRs (Toll like receptors)被譽為連接先天性免疫與獲得性免疫的橋梁,而Toll樣受體2(TLR2)是目前已克隆人類TLRs家族中表達范圍最廣、識別病原微生物及其產物種類最多的分子。它分布于抗原提呈細胞、炎癥細胞、多種組織細胞以及腫瘤細胞等,在細菌、真菌、病毒及其他一些病原體感染中發(fā)揮先天性免疫作用,并通過細胞內的信號轉導過程連接獲得性免疫。目前為止,發(fā)現(xiàn)的TLRs信號轉導通路至少有兩條,根據(jù)接頭蛋白的不同,可將其分為MyD88依賴性和非MyD88依賴性兩條途徑,TLR2主要以MyD88依賴性途徑進行信號轉導。有研究發(fā)現(xiàn)TLR2單克隆抗體可以通過阻斷TLR2-Myd88-NF-KB和TLR2-Myd88-IRF3路徑,減輕移植后急性排斥反應,延長心臟移植物的存活時間。另有學者認為,MyD88缺陷小鼠可誘導供體抗原特異性的腎移植免疫耐受,以此逃避急性和慢性排斥反應。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用抗CD40L抗體后,無論是MyD88缺陷的供體還是受體都可減少移植后炎癥細胞的浸潤。這些研究都說明：TLR2可能通過MyD88下傳信號,參與了同種異體器官移植術后的免疫排斥反應。我們的前期研究也已證實：TLR2可能參與了大鼠角膜移植排斥反應,在同種異體移植組術后第9天檢測到TLR2mRNA的表達特異性增高,與組織病理學結果相吻合,免疫熒光結果顯示TLR2在角膜移植術后第9天表達特異性增高并伴細胞膜轉移。為進一步證實該結論我們通過運用TLR2單克隆抗體阻斷TLR2的表達,觀察移植術后植片的存活情況,臨床觀察術后第9-15d植片的排斥情況并行HE染色觀察,并于術后第9d行免疫組化和實時熒光定量PCR檢測TLR2及其下游信號分子MyD88的表達及分布情況,以進一步證實TLR2及其下游信號分子MyD88在角膜移植術后排斥反應中的重要作用。對TLR2/MyD88信號通路的深入了解不僅有助于我們明確TLR2在角膜移植排斥反應中的作用及其分子基礎,為臨床防治角膜移植排斥提供理論基礎,也有利于某些疾病如腫瘤、微生物感染、過敏和自身免疫性疾病等免疫反應機理的探索,為今后在相應疾病的治療和疫苗研制等方面的研究提供新切入點,為臨床治療這些疾病開辟更為廣闊的路徑。第一部分TLR2單克隆抗體影響大鼠角膜移植術后植片存活情況的實驗研究目的觀察TLR2單克隆抗體對同種異體大鼠角膜移植術后植片的存活情況的影響。方法實驗分為三組：正常對照組(N)、同種異體角膜移植組(A)和同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體給藥組(mAb), A、mAb兩個實驗組大鼠分別行穿透性角膜移植術,同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體組經球結膜下注射給予15ug的TLR2單克隆抗體,自手術當日起隔天給藥,即術后第0、2、4、6、8d,共5次；同種異體移植組術后以同法予等量的生理鹽水。術后每日裂隙燈下觀察角膜的水腫、透明度、新生血管生長情況,并對植片進行排斥反應指數(shù)評分,由2人分別計數(shù)取平均值,記錄各組大鼠角膜植片發(fā)生排斥反應的平均天數(shù)。分別于術后第9d、15d取各組大鼠眼球石蠟包埋行HE染色后電子顯微鏡下觀察各層角膜組織的結構變化。結果術后各組角膜隨時間的變化均表現(xiàn)出不同程度的水腫、混濁及新生血管生成,以同種異體角膜移植組為甚。同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體組發(fā)生排斥反應的時間為(15.67±0.753)d,較同種異體角膜移植組(9.67±0.876)d明顯延遲,且差異有統(tǒng)計學意義(p=0.001)。HE染色結果顯示：正常角膜組織分5層,各層結構清晰,基質層膠原疏松、排列整齊,無炎性細胞浸潤；第9d,同種異體角膜移植組角膜植片厚度增加,基質層結構紊亂,新生血管管腔散在分布,并伴有多量的炎性細胞浸潤；TLR2單克隆抗體組角膜各層結構尚清晰,基質層中僅有少量炎性細胞浸潤；第15d,同種異體角膜移植組角膜增厚明顯,角膜全層結構不清晰,其間可見多量的新生血管管腔和大量的炎性細胞浸潤。而在TLR2單克隆抗體組,角膜各層結構尚清晰,基質層中僅可見少量炎性細胞浸潤。結論TLR2單克隆抗體能有效地延長大鼠同種異體角膜移植術后植片的存活時間,減輕移植術后炎癥反應。第二部分TLR2/MyD88信號系統(tǒng)在大鼠角膜移植術后排斥反應中的作用探討目的探討TLR2/MyD88信號系統(tǒng)在大鼠角膜移植術后免疫排斥反應中的作用。方法實驗分為四組,包括正常對照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組和同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體給藥組,三個手術組大鼠均行穿透性角膜移植術,術后同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體給藥組經球結膜下注射予15ug的TLR2單克隆抗體,自術后當日起隔天給藥,即術后第0、2、4、6、8d,共5次；自體組與同種異體移植組以同法給予等量的生理鹽水。術后每日裂隙燈下觀察角膜的水腫、透明度和新生血管生長情況,并對植片進行排斥反應指數(shù)評分,由2人分別計數(shù)取平均值。術后第9d取各組大鼠眼球石蠟包埋后行HE及免疫組化染色,另取各組大鼠角膜組織行實時熒光定量PCR,檢測角膜組織中TLR2mRNA、MyD88mRNA的表達情況。結果術后隨時間變化各組角膜植片均表現(xiàn)出不同程度的腫脹、渾濁及新生血管生成,特別是在同種異體角膜移植組中。HE染色結果顯示：正常角膜組織分5層,各層結構清晰,基質層膠原疏松、排列整齊,無炎性細胞浸潤；第9d,自體組角膜各層結構清楚,僅基質層中見少量炎性細胞浸潤,余未見明顯異常；TLR2單克隆抗體組角膜各層結構尚清晰,基質層中僅有少量炎性細胞浸潤。而在同種異體組,角膜植片各層結構明顯增厚,基質層結構不清,其間可見新生血管管腔,伴多量的炎性細胞浸潤。免疫組化檢測結果顯示：TLR2和MyD88分子在正常對照組、自體組及TLR2單克隆抗體組的角膜上皮中均有微量表達,而同種異體組角膜上皮、基質細胞中TLR2和MyD88分子的表達明顯增多,尤以基質層明顯。實時熒光定量PCR結果顯示：在正常對照組(1.01±0.213,1.00±0.07)、自體移植組(3.40±1.007,2.42±0.479)、同種異體移植組(23.7±1.974,4.11±0.572)和TLR2單克隆抗體組(12.87±2.001,2.32±0.758)中都檢測到TLR2mRNA和MyD88mRNA的表達；同種異體組TLR2mRNA、 MyD88 mRNA表達程度較正常對照組和自體組明顯上升,而在TLR2單克隆抗體組(mAb組)中二者表達較異體組明顯降低,且趨勢一致;將各組TLR2mRNA、 MyD88mRNA的表達差異進行統(tǒng)計學分析,先進行方差齊性檢驗TLR2: p=0.081,方差齊；MyD88:p=0.145,方差齊。然后選用LSD法兩兩之間進行比較,MyD88RNA在三個手術干預組中的表達均較正常對照組顯著升高(P=0.012,0.016,0.000),在TLR2單克隆抗體組中的表達也明顯低于同種異體角膜移植組(P=0.003),TLR2mRNA除了在正常對照組與自體組之間無顯著差異(P=0.098)外,正常對照組、TLR2單克隆抗體組及同種異體組之間的組間比較都有明顯差異,且其表達趨勢與MyD88基本一致。結論TLR2單克隆抗體抑制TLR2及其下游信號分子MyD88的表達；TLR2/MyD88信號系統(tǒng)參與了角膜移植術后排斥反應,影響了角膜植片的轉歸。
【關鍵詞】：角膜移植 TLR2 單克隆抗體 存活時間 TLR2單克隆抗體 TLR2/MyD88信號系統(tǒng) 角膜移植 免疫排斥
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R779.6
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-28
• 1 角膜移植排斥反應的研究現(xiàn)狀17-18
• 2 TLR2/MyD88信號系統(tǒng)的生物學特性18-20
• 3 TLR2/MyD88信號系統(tǒng)在移植免疫排斥中的研究進展20-22
• 4 立題依據(jù)及意義22-23
• 參考文獻23-28
• 第一部分 TLR2單克隆抗體影響大鼠角膜移植術后植片存活情況的實驗研究28-43
• 1.1 材料29-30
• 1.2 方法30-32
• 1.3 結果32-36
• 1.4 討論36-39
• 參考文獻39-43
• 第二部分 TLR2/MYD88信號系統(tǒng)在大鼠角膜移植術后排斥反應中的作用探討43-64
• 2.1 材料44-45
• 2.2 方法45-51
• 2.3 結果51-57
• 2.4 討論57-60
• 參考文獻60-64
• 全文小結64-66
• 縮寫詞中英文對照表66-67
• 研究成果67-68
• 致謝68-70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 白浪;陸曉和;鐘彥彥;張靜;周瑾;武海軍;;糖皮質激素對角膜移植術后大鼠角膜TLR2表達的影響[J];眼科研究;2009年11期

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本文編號：567137