本文關(guān)鍵詞：耳部術(shù)腔上皮缺損組織工程學修復(fù)的基礎(chǔ)研究

  更多相關(guān)文章： 耳部 組織工程 上皮修復(fù) 脂肪間充質(zhì)干細胞 細胞外基質(zhì) 共培養(yǎng)

【摘要】：耳部病變,例如耳部腫瘤、中耳膽脂瘤、外傷、先天性畸形等手術(shù)去除病變后可遺留局部皮膚缺損,形成的顳骨裸露骨面需要修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn),仍有3%-40%的患者術(shù)后上皮化進展緩慢或上皮化不全。組織液從骨壁滲透到中耳或乳突腔可引起細菌感染和肉芽組織增生,易于形成瘢痕組織,或造成術(shù)腔狹窄。臨床上通常使用皮膚、骨膜瓣、骨粉、顳骨筋膜或者脂肪修復(fù),也有部分同種異體或異種移植物。盡管這些修復(fù)材料的應(yīng)用取得了一定的療效,但是部分再次手術(shù)病人則存在供區(qū)損傷或組織數(shù)量不足的問題,目前仍未找到一種理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于細胞定植,能支持顳骨皮膚結(jié)構(gòu)與功能恢復(fù)的上皮修復(fù)材料,以及相關(guān)的技術(shù)方法與手段。本文旨在應(yīng)用組織工程原理與技術(shù)將細胞和支架材料相結(jié)合,探索通過生物制造方法,構(gòu)建組織工程化皮膚,替代和修復(fù)耳部術(shù)腔和顳骨創(chuàng)面皮膚。研究目的(1)建立體外分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的方法,并觀察其形態(tài)及生物學特性,探討其作為耳部術(shù)腔上皮組織工程種子細胞的可行性。(2)構(gòu)建脂肪間充質(zhì)干細胞聚合物(adipose-derived stem cell aggregates,ADSC aggregates)-細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)復(fù)合物補片(ADSC aggregates-ECM),觀察ADSCs在ECM支架上復(fù)合培養(yǎng)時的生長狀況,并探討ECM作為組織工程支架材料的可行性。(3)構(gòu)建新西蘭兔耳廓和外耳道的皮膚缺損模型,并采用復(fù)合物補片和單純ECM支架兩種方式修復(fù)創(chuàng)面,比較兩種方式修復(fù)創(chuàng)面愈合情況及炎癥狀況,探討復(fù)合物補片促進創(chuàng)面愈合的作用和機制。研究方法(1)優(yōu)化Zuk分離、純化和培養(yǎng)ADSCs的方法,采用誘導(dǎo)多向分化、鑒定表面分子、繪制生長曲線等方法進行干細胞生物特性驗證。(2)接種ADSCs于ECM支架上,采用掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞術(shù)觀察ADSCs在ECM支架上形成聚合物狀況;RT-PCR技術(shù)檢測ADSCs培養(yǎng)時自分泌活性因子情況。(3)采用手術(shù)剪除和打孔的方法建立新西蘭兔耳廓和外耳道全層皮膚創(chuàng)傷模型。兩種模型均隨機分為3組,分別將復(fù)合物補片及單純ECM支架移植入創(chuàng)面,設(shè)立空白對照組,分別于第2、4、7周在體和組織學觀察3組術(shù)區(qū)的滲液、肉芽組織增生和感染情況,并計算創(chuàng)面愈合率;于第1、2周提取創(chuàng)面新生組織的蛋白,進行Western Blot檢測,對比不同移植組促組織愈合的新生因子分泌情況。研究結(jié)果(1)ADSCs形態(tài)均一、呈纖維細胞樣生長,具有成脂、成骨分化潛能。流式檢測ADSCs高表達CD29,CD90,低表達CD14,CD45。細胞有明顯的指數(shù)生長期。(2)ADSCs在ECM支架表面具有較好的粘附性,重疊生長,細胞間緊密連接,未出現(xiàn)大量凋亡。且ADSCs在ECM支架上分泌HGF、TGF-β、b FGF、EGF功能明顯高于無支架組(P0.05)。(3)在外耳道創(chuàng)面模型中,術(shù)后第4周,ADSC aggregates-ECM組較ECM組、對照組上皮愈合更近似周邊組織,HE染色發(fā)現(xiàn)ADSC aggregates-ECM組較其他兩組能形成正常的上皮類似結(jié)構(gòu)。(4)在第1周和第2周,ADSC aggregates-ECM組和ECM組缺損部位分泌的b FGF EGF,HGF,VEGF和TGF-β1顯著高于對照組。(5)耳廓創(chuàng)面模型中,術(shù)后第2周,ADSC aggregates-ECM組創(chuàng)面愈合率明顯高于ECM組和對照組。組織學HE染色發(fā)現(xiàn):對照組較另外兩組創(chuàng)面浸潤大量炎性細胞。第4周,三組創(chuàng)面皮膚均愈合,炎性細胞減少。第7周,三組創(chuàng)面瘢痕逐漸減退。ADSC aggregates-ECM組和ECM組瘢痕厚度均低于對照組(p0.05)。研究結(jié)論(1)體外培養(yǎng)的兔ADSCs具有間充質(zhì)干細胞特性,可作為耳部術(shù)腔上皮組織工程種子細胞。(2)ECM支架為細胞的生長、爬行提供了良好的微環(huán)境。同時對于細胞表達多種生長因子有更好的促進作用。是一種具有潛在應(yīng)用價值的組織工程支架材料。(3)移植到創(chuàng)面后,ADSC aggregates ECM和單純的ECM支架均有利于耳部創(chuàng)面的愈合,且ADSC aggregates ECM能降低創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)強度,促進創(chuàng)面愈合,減小瘢痕厚度,效果優(yōu)于單純的ECM支架組和空白對照組。本研究為修復(fù)耳部術(shù)后的顳骨上皮缺損提供了有意義的實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：耳部 組織工程 上皮修復(fù) 脂肪間充質(zhì)干細胞 細胞外基質(zhì) 共培養(yǎng)
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R764.9
【目錄】：

• 中英文縮略詞表9-12
• 中文摘要12-15
• Abstract15-19
• 前言19-23
• 第一部分 種子細胞分離培養(yǎng)和鑒定23-30
• 1 引言23
• 2 實驗材料23-24
• 2.1 實驗動物23
• 2.2 主要試劑23-24
• 2.3 主要儀器24
• 3 實驗方法24-26
• 3.1 腹部脂肪的取材24
• 3.2 ADSCs的原代培養(yǎng)24
• 3.3 ADSCs的傳代培養(yǎng)24-25
• 3.4 ADSCs的多向分化能力鑒定25
• 3.4.1 成脂誘導(dǎo)25
• 3.4.2 成骨誘導(dǎo)25
• 3.5 ADSCs表面抗原檢測25-26
• 3.6 ADSCs增殖26
• 4 實驗結(jié)果26-27
• 4.1 ADSCs形態(tài)學觀察26-27
• 4.2 ADSCs分化潛能鑒定27
• 4.3 ADSCs表面抗原檢測27
• 4.4 ADSCs生長曲線測定27
• 5 討論27-30
• 第二部分 ADSC aggregates-ECM復(fù)合物培養(yǎng)30-40
• 1 引言30
• 2 實驗材料30-31
• 2.1 支架材料30
• 2.2 主要試劑30
• 2.3 主要儀器30-31
• 3 實驗方法31-35
• 3.1 ECM的HE染色31-32
• 3.2 ADSC aggregates-ECM復(fù)合物構(gòu)建32
• 3.3 ADSC aggregates-ECM復(fù)合物檢測32-35
• 3.3.1 SEM觀察ADSCs粘附性及成聚合物狀態(tài)32
• 3.3.2 激光共聚焦顯微鏡觀察ADSCs在ECM上活性和凋亡情況32-33
• 3.3.3 流式細胞分析ADSCs在ECM上生長周期情況33
• 3.3.4 細胞因子表達的檢測33-35
• 3.3.4.1 ADSCs和復(fù)合物總RNA的提取33-34
• 3.3.4.2 ADSCs和復(fù)合物c DNA的反轉(zhuǎn)錄34
• 3.3.4.3 RT-PCR檢測34-35
• 3.3.4.4 統(tǒng)計35
• 4 結(jié)果35-36
• 4.1 ECM形態(tài)學觀察35
• 4.2 ADSCs在ECM中培養(yǎng)和形態(tài)學觀察35-36
• 4.3 ADSCs在ECM中凋亡情況36
• 4.4 ADSCs在ECM中生長周期情況36
• 4.5 ADSCs在ECM中細胞因子和蛋白表達量的比較36
• 5 討論36-40
• 5.1 支架的選擇36-38
• 5.2 ECM支架對ADSCs的影響38
• 5.3 細胞與支架表層界面的相互作用38-40
• 第三部分 ADSC aggregates -ECM修復(fù)兔急性皮膚創(chuàng)面效果的體內(nèi)檢測40-56
• 1 引言40
• 2 實驗材料40-41
• 2.1 實驗動物和支架材料40-41
• 2.2 主要試劑41
• 2.3 主要儀器41
• 3 實驗方法41-45
• 3.1 實驗動物的飼養(yǎng)41
• 3.2 動物創(chuàng)面模型的建立和移植物移植41-42
• 3.2.1 新西蘭大白兔耳廓全層皮膚缺損模型的建立41-42
• 3.2.2 新西蘭大白兔外耳道內(nèi)壁全層皮膚缺損模型的建立42
• 3.3 實驗動物取材和組織形態(tài)學的比較實驗方法42-43
• 3.3.1 三組動物創(chuàng)面大小比較42
• 3.3.2 三組動物創(chuàng)面組織炎癥和愈合后瘢痕情況的比較42-43
• 3.4 創(chuàng)面相關(guān)細胞因子表達情況檢測43-44
• 3.4.1 蛋白樣品的提取43
• 3.4.2 蛋白含量的測定43
• 3.4.3 SDS-PAGE電泳43-44
• 3.4.4 轉(zhuǎn)膜44
• 3.4.5 封閉44
• 3.4.6 免疫反應(yīng)44
• 3.4.7 化學發(fā)光44
• 3.5 統(tǒng)計44-45
• 4 結(jié)果45-46
• 4.1 大體觀察45
• 4.2 組織學HE染色45-46
• 4.3 外耳道內(nèi)壁創(chuàng)面相關(guān)細胞因子表達情況46
• 5 討論46-49
• 5.1 移植物促進創(chuàng)面愈合及作用機制46-48
• 5.2 動物模型的選擇48-49
• 附圖49-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-66
• 附錄66-68
• 致謝68-69
• 綜述一69-77
• 參考文獻73-77
• 綜述二77-87
• 參考文獻84-87

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