本文關鍵詞：誘導多能干細胞株的建立及過表達抗凋亡基因Bcl-2的iPSCs構建

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【摘要】：研究背景感音神經性耳聾主要是由毛細胞、螺旋神經節(jié)的衰亡所致,哺乳動物的耳蝸細胞在出生后喪失再生修復能力,在受到耳毒性藥物、感染、噪音等嚴重創(chuàng)傷后,內耳細胞可能發(fā)生變性,甚至壞死、凋亡,聽力將不可逆性下降。干細胞耳蝸植入作為內耳疾病的一種治療手段,有望實現毛細胞、螺旋神經節(jié)的再生修復,從而重建聽力。誘導多能干細胞(iPSCs),是將體細胞重編程為類似胚胎干細胞的一類具有多能性的干細胞,可以作為細胞治療的供體,并已在多個領域產生極好的效果。然而內耳移植環(huán)境的損傷狀態(tài)、干細胞移植存活率低下一直是內耳再生修復領域的兩大困擾,是否可以通過以干細胞治療為基礎,結合基因干預的手段,同時解決上述兩個問題。基于以上情況,我們展開了如下研究。目的構建尿液來源的誘導多能干細胞,為內耳疾病的治療提供候選細胞；構建過表達抗凋亡基因Bcl-2的iPSCs,為實現內耳疾病細胞、基因聯合治療模式的探究提供前期準備。方法獲取來自正常人的尿液樣本,通過經典的四因子0ct4, Sox2, c-myc和Klf4途徑誘導多能干細胞并完成其多能性驗證；通過構建攜帶Bcl-2抗凋亡基因的慢病毒,感染iPSCs,驗證過表達Bcl-2對其生存、分化及全能性的影響,并測定過表達Bcl-2的iPSCs誘導的神經元的神經營養(yǎng)因子分泌水平。結果1.完成了尿液來源的正常人iPSCs的構建1.1分離、獲得正常人的尿液來源的上皮細胞系,細胞呈纖維樣、上皮樣,且分裂增殖速度快,狀態(tài)良好。1.2四因子誘導的iPSCs細胞株建立,克隆呈類圓形,邊界清晰、銳利,克隆內細胞均一、核大、排列致密,且核質比高。1.3堿性磷酸酶活性呈強陽性；SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、0CT4、NANOG等抗原呈陽性表達；內源性ES標志性基因0CT4、S0X2、KLF4、NANOG能激活并表達；外源性基因0ct4, Sox2, c-myc和Klf4均整合入iPSCs基因組,但均未被表達激活；擬胚體、畸胎瘤形成實驗均鑒定陽性。檢測證實構建的iPSCs具有全能性,且無致癌基因c-Myc的表達。2.成功構建了過表達Bcl-2抗凋亡基因的iPSCs2.1構建攜帶Bcl-2的重組慢病毒。2.2構建過表達Bcl-2的iPSCs,并驗證其存活,擬胚體形成、神經元的分化能力均不受影響。2.3過表達Bcl-2的iPSCs誘導的神經元,BDNF、NT3水平顯著提高,而NGF的表達水平無明顯改變。結論1.人的尿液中可以獲得分裂、增殖能力良好的上皮細胞。2.經尿液來源的上皮細胞誘導的iPSCs細胞株具有分化全能性。3.Bcl-2基因可以通過重組慢病毒構建,且能感染iPSCs細胞。4.過表達Bcl-2抗凋亡基因的iPSCs,其存活、分化、多能性無明顯差異。5.過表達Bcl-2的iPSCs誘導的神經元細胞,BDNF、NT3等神經營養(yǎng)因子的分泌水平提高,NGF無明顯差異。
【關鍵詞】：誘導多能干細胞 Bcl-2家族蛋白 感音神經性耳聾 細胞治療 基因治療
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 本課題中使用到的主要儀器11-12
• 主要試劑的配制12-14
• 英文縮寫注釋14-16
• 1 前言16-20
• 2 材料與方法20-31
• 2.1 實驗材料20
• 2.2 標本收集20-21
• 2.3 誘導多能干細胞株建立、鑒定21-27
• 2.4 過表達Bcl-2的iPSCs構建27-31
• 3 結果31-39
• 4 討論39-43
• 5 結論43-44
• 參考文獻44-50
• 綜述50-61
• 參考文獻56-61
• 個人簡歷61

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1 ;我國科學家發(fā)現阻礙誘導多能干細胞形成的“路障”[J];生物學教學;2013年05期

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本文編號：537377