本文關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激在間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中自噬變化的機(jī)制研究

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【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是最常見(jiàn)的睡眠呼吸障礙,神經(jīng)認(rèn)知功能障礙是其常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。其發(fā)生可能與OSAHS的特征性病理生理學(xué)改變間歇低氧有關(guān)。間歇低氧可導(dǎo)致大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞不同程度損傷,如細(xì)胞凋亡、炎性損傷等。自噬作為真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng),與缺血/缺氧所致的細(xì)胞損傷存在一定的聯(lián)系。我們前期研究已證實(shí)自噬可能同樣參與了間歇低氧所致的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷,但其機(jī)制尚不清楚。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是間歇低氧所致各系統(tǒng)損傷的病理機(jī)制之一,也是細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生的重要原因。因此,我們推測(cè)氧化應(yīng)激可能介導(dǎo)了間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中自噬的變化。本研究即通過(guò)模擬OSAHS建立間歇低氧模型,從體外水平研究觀察間歇低氧及抗氧化干預(yù)對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬強(qiáng)度、活性氧水平及細(xì)胞損傷程度的影響,探討氧化應(yīng)激在間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中自噬發(fā)生變化的作用及機(jī)制。方法取出生24h內(nèi)的SD乳鼠,分離海馬組織,接種細(xì)胞懸液進(jìn)行原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),通過(guò)光學(xué)顯微鏡分別觀察細(xì)胞培養(yǎng)第1、3、5、7天海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。①將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、間歇低氧4h組、間歇低氧8h組、間歇低氧12h組,應(yīng)用間歇低氧模式(循環(huán)給予:常氧為21%O2,5%CO2和平衡N2,持續(xù)10min;低氧為1.5%O2,5%CO2和平衡N2,持續(xù)5min,一次循環(huán)15min)處理各間歇低氧組海馬神經(jīng)細(xì)胞,建立4h、8h、12h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的間歇低氧細(xì)胞模型,正常對(duì)照組持續(xù)給予21%的常氧。通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞膜標(biāo)記蛋白MAP-2的表達(dá),進(jìn)行原代海馬神經(jīng)細(xì)胞鑒定。通過(guò)免疫印跡法和免疫熒光法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3-II、Beclin1的表達(dá),DCF免疫熒光法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS水平,TUNEL法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率;②將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、間歇低氧組、抗氧化干預(yù)組、間歇低氧+抗氧化干預(yù)組,給予細(xì)胞N-乙酰半胱氨酸(NAC)抗氧化干預(yù)處理,選取ROS及自噬表達(dá)變化最明顯的間歇低氧時(shí)間點(diǎn)12h進(jìn)行間歇低氧處理,建立N-乙酰半胱氨酸(NAC)抗氧化干預(yù)的間歇低氧細(xì)胞模型,正常對(duì)照組及單純抗氧化干預(yù)組分別持續(xù)給予21%的常氧。通過(guò)免疫印跡法和免疫熒光法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3-II及cleaved-caspase-3的表達(dá),DCF免疫熒光法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS水平,TUNEL法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果①原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的光鏡觀察圖與鑒定:光鏡下可見(jiàn)第1天細(xì)胞出現(xiàn)分支及雙極突起,第3天細(xì)胞胞體增大,突起向外延伸,部分細(xì)胞聚集成簇生長(zhǎng),至第5-7天,細(xì)胞胞體成熟飽滿(mǎn),突起粗壯可交織成網(wǎng);免疫熒光檢測(cè)MAP-2結(jié)果顯示,海馬神經(jīng)細(xì)胞其胞體和突起呈現(xiàn)MAP-2表達(dá)的紅色熒光。②間歇低氧不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬、ROS表達(dá)及凋亡的檢測(cè):免疫印跡及免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著間歇低氧時(shí)間延長(zhǎng),自噬標(biāo)記蛋白LC3-II、Beclin1的表達(dá)也逐漸增高,間歇低氧12h組表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DCF免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著間歇低氧時(shí)間延長(zhǎng),海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS表達(dá)也逐漸增高,間歇低氧12h組表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著間歇低氧時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡率也逐漸增高,間歇低氧12h組較正常對(duì)照組顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。③抗氧化干預(yù)間歇低氧處理后海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬、ROS表達(dá)及凋亡的檢測(cè):免疫印跡及免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示,間歇低氧組自噬標(biāo)記蛋白LC3-II的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高,間歇低氧+抗氧化干預(yù)組自噬標(biāo)記蛋白LC3-II的表達(dá)較間歇低氧組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DCF免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示,間歇低氧組海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高,間歇低氧+抗氧化干預(yù)組ROS表達(dá)較間歇低氧組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,間歇低氧組cleaved-caspase-3的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高,間歇低氧+抗氧化干預(yù)組cleaved-caspase-3的表達(dá)較間歇低氧組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示,間歇低氧組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組顯著增高,間歇低氧+抗氧化干預(yù)組細(xì)胞凋亡率較間歇低氧組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論本研究證實(shí):①ROS可能參與了間歇低氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬的改變;②抗氧化干預(yù)可減輕間歇低氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡。綜上所述,氧化應(yīng)激介導(dǎo)了間歇低氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬的改變,而且氧化應(yīng)激介導(dǎo)的自噬可能加重了間歇低氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征 海馬神經(jīng)細(xì)胞 間歇低氧 氧化應(yīng)激 自噬 細(xì)胞凋亡 N-乙酰半胱氨酸
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R766
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 1 對(duì)象和方法15-28
• 2 結(jié)果28-39
• 3 討論39-45
• 4 小結(jié)45-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明54-56
• 綜述56-67
• 綜述參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67

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