本文關(guān)鍵詞：非基因重編程及生物模擬誘導(dǎo)促進(jìn)ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細(xì)胞，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞球注射移植的影響目的:3D球形培養(yǎng)和ROCK抑制劑對提高細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞增殖有很好的作用,本研究的目的是探索ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞(B-CECs)在體外的生長,可注射移植,以及球形3D培養(yǎng)的影響。方法:采用胰酶消化法從屠宰場獲得的牛眼球中分離得到原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞(B-CEC),采用多細(xì)胞微球具模型進(jìn)行B-CEC的球形培養(yǎng)并利用細(xì)胞死活染色、Ed U染色和CCK-8檢測評估ROCK抑制劑對B-CEC球與B-CECs增殖和活性的影響。利用體外可注射移植實(shí)驗(yàn)分析ROCK抑制劑對B-CEC球在細(xì)胞培養(yǎng)板和仿生脫細(xì)胞角膜貼壁能力的影響,倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果:免疫熒光染色表明Y-23672不改變CECs的表型,但通過細(xì)胞死活染色實(shí)驗(yàn)、Ed U染色實(shí)驗(yàn)和CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Y-23672可以顯著提高B-CECs與B-CEC球細(xì)胞的活性和增殖。采用多細(xì)胞微球具模型形成大小均勻的B-CEC球比單散CECs有更高分化潛能。體外模擬移植可注射性實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)Y-23672處理的成球一天移植到細(xì)胞板或脫細(xì)胞角膜貼壁5天的B-CEC球可以貼壁完全并成鋪路石樣的單層細(xì)胞,而無Y-23672處理的對照組B-CEC球接種后仍有細(xì)胞聚集。結(jié)論:與2D培養(yǎng)相比較,3D培養(yǎng)法能使B-CEC球有更高的分化潛能;ROCK抑制劑可以提升球形培養(yǎng)B-CEC的活力,促進(jìn)球形培養(yǎng)的B-CEC的增殖、遷移,且不改變B-CEC固有的基因和蛋白的表達(dá);我們的研究結(jié)果表明3D瓊脂糖球形培養(yǎng)法結(jié)合ROCK抑制劑是形成含有角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞和體外模擬移植可注射性B-CEC球?qū)槲磥鞢EC的治療有重要的應(yīng)用意義。第二部分非基因重編程及生物模擬誘導(dǎo)促進(jìn)ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細(xì)胞目的:探索重組蛋白和小分子在模擬微重力條件下對促進(jìn)脂肪干細(xì)胞(ADSC)重編程成為角膜內(nèi)皮(CEC)樣細(xì)胞的影響,目標(biāo)是要了解重組蛋白質(zhì),小分子和仿生環(huán)境的組合能否為促進(jìn)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞建立起非基因直接重編程平臺系統(tǒng)。方法:使用膠原酶消化法分離原代ADSC,并對細(xì)胞進(jìn)行表型的鑒定。利用帶有穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2(PTD-OKS)以及小分子(Purmorphamine,RG108等重編程化合物)在模擬微重力反應(yīng)器(SMG)中進(jìn)行ADSC的重編程誘導(dǎo)。重編程后的ADSC在插入式共培養(yǎng)系統(tǒng)與絲裂霉素C處理的CEC以及角膜緣基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)并接種到脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)進(jìn)一步培養(yǎng),RT-PCR和免疫熒光鑒定直接重編程后細(xì)胞的基因、蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:通過流式細(xì)胞術(shù),成脂成骨分化法鑒定ADSC。使用帶穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2(PTD-OKS)以及小分子(Purmorphamine,RG108等重編程化合物)在模擬微重力反應(yīng)器(SMG)中誘導(dǎo)后,RT-PCR和免疫熒光分析表明ADSCs陽性表達(dá)Nanog和CD34。共培養(yǎng)后的ADSC接種到脫細(xì)胞角膜上成熟后,細(xì)胞形態(tài)由紡錘樣變?yōu)槎嘟切?免疫熒光顯示直接重編程后的ADSCs弱陽性表達(dá)CD31、AQP-1、ZO-1。結(jié)論:ADSC經(jīng)過重組蛋白與小分子在模擬微重力條件下重編程誘導(dǎo)后,具有更高的分化潛能;與CEC以及角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)分化后接種到脫細(xì)胞角膜上呈現(xiàn)鋪路石樣六角形細(xì)胞形態(tài),且陽性表達(dá)角膜內(nèi)皮標(biāo)志物CD31、AQP-1、ZO-1。這些發(fā)現(xiàn)初步實(shí)現(xiàn)了ADSC直接重編程為CEC。我們的研究也首次表明SMG旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以用作非基因手段促進(jìn)直接重編程。非基因重編程為特異性多能干細(xì)胞的可塑性研究和未來自體CEC替代療法提供了新的選擇,從而避免了使用多能干細(xì)胞療法引起的并發(fā)癥的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：角膜內(nèi)皮細(xì)胞 ROCK抑制劑 仿生脫細(xì)胞角膜 脂肪來源干細(xì)胞 直接重編程 角膜內(nèi)皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R77;Q813
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-16
• 1 間充質(zhì)干細(xì)胞9
• 2 脂肪干細(xì)胞9-10
• 3 角膜內(nèi)皮細(xì)胞10-11
• 4 三維微重力旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）及應(yīng)用11-12
• 5 非基因重編程和轉(zhuǎn)分化12-13
• 6 細(xì)胞球形培養(yǎng)13-16
• 本實(shí)驗(yàn)研究目的、意義及內(nèi)容16-24
• 參考文獻(xiàn)17-24
• 第一部分Y-27632對牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞球可注射移植的影響研究引言24-44
• 引言24
• 材料與方法24-31
• 結(jié)果31-34
• 討論34-36
• 附圖36-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 第二部分 非基因重編程及生物模擬誘導(dǎo)促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞直接重編程為角膜內(nèi)皮細(xì)胞引言44-70
• 引言44
• 材料與方法44-55
• 結(jié)果55-57
• 討論57-60
• 附圖60-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 全文結(jié)論70-71
• 英文詞匯縮略注釋71-72
• 在校期間發(fā)表文章及科研成果72-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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4 李紅陽;李曉霞;余榕捷;劉曉飛;王靜靜;蘇航;陳建蘇;;帶有穿膜肽PTD的重組Oct4的制備及活性鑒定[J];中國病理生理雜志;2011年09期

5 譚美華;陳建蘇;招志毅;丁勇;鐘敬祥;戴應(yīng);李善義;楊皓莊;;共培養(yǎng)環(huán)境中兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)人iPSCs分化[J];中國病理生理雜志;2012年08期

  本文關(guān)鍵詞：非基因重編程及生物模擬誘導(dǎo)促進(jìn)ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細(xì)胞，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：452483