本文關(guān)鍵詞：酪氨酸促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮高效分化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的觀察酪氨酸(L-Tyrosine)對(duì)人胚胎干細(xì)胞(h ESCs)向視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)效率的影響。方法1.人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離(1)人胚胎干細(xì)胞H1(h ESCs)在Matrigel包被的培養(yǎng)板上使用m Te SR培養(yǎng)基單層貼壁培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)。(2)酶消化法分離人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài),使用RP-PCR和Western blot檢測(cè)RPE標(biāo)志。2.人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞定向分化(1)誘導(dǎo)分化人胚胎干細(xì)胞H1(h ESC)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,以m Te SR培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞克隆過(guò)度融合后對(duì)照組以撤除堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b FGF)、含10%KSR的培養(yǎng)基誘導(dǎo)h ESCs自主分化。實(shí)驗(yàn)組從誘導(dǎo)分化第14天開始在誘導(dǎo)體系中分別添加0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L和0.5 mmol/L酪氨酸,處理7天,探索最適酪氨酸誘導(dǎo)濃度;從誘導(dǎo)分化第0天、第7天、第14天、第21天和第28天開始在誘導(dǎo)體系中分別按篩選出的最適酪氨酸誘導(dǎo)濃度添加酪氨酸,處理7天,探索最適酪氨酸誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn);使用酪氨酸最適誘導(dǎo)濃度在最適時(shí)間點(diǎn)開始誘導(dǎo),處理7天。3.鑒定(1)體外功能鑒定分別檢測(cè)各組細(xì)胞誘導(dǎo)分化第35天、第49天,hRPE,hESCs和純化的h ESCs-RPE細(xì)胞MITF、RPE65、PAX6、CRALBP、RX、PEDF、ZO1、BF1、Tyrosinase、Wnt3a、Lef1、Tcf7、c-myc基因m RNA的相對(duì)表達(dá);蛋白免疫印跡法檢測(cè)PAX6、MITF、RPE65、CRALBP和β-catenin蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0.2 m M酪氨酸處理組和對(duì)照組PAX6、CRALBP、MITF、ZO1和RPE65陽(yáng)性細(xì)胞比例;細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)純化h ESCs-RPE PAX6、CRALBP、MITF、ZO1和RPE65蛋白表達(dá)水平。(2)h ESCs-RPE對(duì)急性視網(wǎng)膜變性大鼠視功能具有保護(hù)作用16只視網(wǎng)膜變性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組,單眼內(nèi)路法視網(wǎng)膜下腔注射,對(duì)照組注射2ul 1倍磷酸鹽緩沖液,治療組注射2 ul純化的h ESCs-RPE(1x106個(gè))。治療6周后行視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢查,觀察暗適應(yīng)3.0 a-b波振幅。結(jié)果1.誘導(dǎo)分化第22天,0.2 m M酪氨酸處理組開始出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色素團(tuán)塊,誘導(dǎo)分化第5周0.2 m M酪氨酸處理組色素團(tuán)塊明顯多于對(duì)照組。色素化區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)多邊形蜂窩狀排列的單層細(xì)胞,胞質(zhì)充滿色素顆粒,與人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形態(tài)相近。2.RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)單因素方差分析各濃度處理組在誘導(dǎo)分化第35天和第49天RPE特異性基因PAX6、CRALBP、MITF、RPE65、BF1、PEDF、RX、Tyrosinase和ZO1基因表達(dá)量均高于對(duì)照組(p=0.000),其中0.2 m M和0.5 m M處理組各基因第35天和49天表達(dá)量均明顯高于其他組(p=0.000);與對(duì)照組相比,各時(shí)間點(diǎn)使用0.2 m M L-Tyrosine對(duì)h ESCs-RPE誘導(dǎo)的RPE特異性基因PAX6、CRALBP、MITF、RPE65、BF1、PEDF、RX、Tyrosinase和ZO1的相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),其中d7、d21和d28加入0.2 m M L-Tyrosine處理組細(xì)胞MITF、RPE65、ZO1、Tyrosinase基因表達(dá)量明顯高于其他組(p=0.000)。酪氨酸處理組Wnt3a、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Lef1、Myc、Tcf7 m RNA表達(dá)量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,酪氨酸處理組MITF、RPE65、CRALBP、PAX6、β-catenin蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組。ICC檢測(cè)結(jié)果顯示純化的h ESCs-RPE表達(dá)RPE標(biāo)志蛋白R(shí)PE65、PAX6、CRALBP、ZO1和MITF。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)分化第35天L-Tyrosine處理組MITF、PAX6和RPE65陽(yáng)性比例分為25.97%±3.31%,82.18%±6.42%,13.82%±0.47%,對(duì)照組分別為9.53%±1.01%,31.72%±5.89%,6.13%±1.18%,差異顯著(t=4.755,p=0.009;t=5.794,p=0.029;t=6.067,p=0.004)。誘導(dǎo)分化第49天L-Tyrosine處理組MITF、CRALBP和RPE65陽(yáng)性比例分為60.65%±1.71%,24.38%±2.21%,44.70%±2.10%,對(duì)照組分別為17.41%±1.29%,10.92%±1.53%,8.72%±0.73%,差異顯著(t=20.18,p=0.000;t=5.150,p=0.007;t=16.19,p=0.000)ERG檢查結(jié)果顯示,視網(wǎng)膜下腔注射h ESC-RPE 6周后視網(wǎng)膜變性大鼠暗適應(yīng)0.01,3.0和30.0 a-b波幅較對(duì)照組顯著提高(P0.01)。結(jié)論酪氨酸顯著提高h(yuǎn) ESCs向RPE定向誘導(dǎo)效率,對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的影響為其可能的作用機(jī)制。h ESCs誘導(dǎo)來(lái)源的RPE細(xì)胞視網(wǎng)膜下移植能改善急性視網(wǎng)膜變性模型動(dòng)物視功能。
【關(guān)鍵詞】：胚胎干細(xì)胞 分化 視網(wǎng)膜色素上皮 酪氨酸
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 1.1 材料和儀器15-21
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞15
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物15
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑15-17
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器和耗材17-18
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)所用溶液及制方法18-21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-39
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)21-27
• 1.2.1.1 人胚胎干細(xì)胞H1體外培養(yǎng)、傳代21-23
• 1.2.1.2 人胚胎干細(xì)胞 H1 向人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)23-24
• 1.2.1.3 人胚胎干細(xì)胞源性視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離、純化培養(yǎng)、傳代和凍存24-26
• 1.2.1.4 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（h RPE）的分離、體外純化培養(yǎng)、傳代和凍存26-27
• 1.2.2 細(xì)胞總 RNA 提取及濃度測(cè)定27-28
• 1.2.3 RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA28
• 1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)28-30
• 1.2.5 細(xì)胞蛋白提取及濃度測(cè)定30-32
• 1.2.6 免疫印跡試驗(yàn)鑒定hESCs-RPE細(xì)胞32-33
• 1.2.7 細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)鑒定hESCs-RPE細(xì)胞33-34
• 1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) L-Tyrosine 處理組和對(duì)照組誘導(dǎo)效率34-36
• 1.2.9 碘酸鈉誘導(dǎo)急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型36
• 1.2.10 純化的 h ESCs-RPE 移植對(duì)急性視網(wǎng)膜變性大鼠視功能保護(hù)作用36-37
• 1.2.11 L-Tyrosine 促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞高效分化機(jī)制的初步研究37-39
• 1.3 結(jié)果39-62
• 1.3.1 人胚胎干細(xì)胞 H1 體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征39
• 1.3.2 不同濃度 L-Tyrosine 對(duì) h ESCs-RPE 誘導(dǎo)效率的影響39-43
• 1.3.3 不同時(shí)間點(diǎn) L-Tyrosine 處理對(duì) h ESCs-RPE 誘導(dǎo)效率的影響43-46
• 1.3.4 形態(tài)學(xué)觀察比較 L-Tyrosine 處理組與對(duì)照組誘導(dǎo)效率46-47
• 1.3.5 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)比較 L-Tyrosine 處理組與對(duì)照組誘導(dǎo)效率47-51
• 1.3.6 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定51
• 1.3.7 hESCs-RPE細(xì)胞純化和鑒定51-56
• 1.3.8 視網(wǎng)膜下腔移植 h ESCs-RPE 對(duì)急性視網(wǎng)膜色素變性大鼠模型視功能的保護(hù)作用56-57
• 1.3.9 L-Tyrosine 促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞高效分化的可能的機(jī)制研究57-62
• 1.4 討論62-67
• 1.4.1 人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)62-63
• 1.4.2 RPE 細(xì)胞特異性標(biāo)記63-64
• 1.4.3 hRPE獲取和鑒定64-65
• 1.4.4 L-Tyrosine 促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮定向高效分化65-66
• 1.4.5 hESCs-RPE體內(nèi)功能初步鑒定66-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明71-72
• 綜述72-76
• 綜述參考文獻(xiàn)76-79
• 致謝79

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本文編號(hào)：399440