目的構建表達視覺系統(tǒng)同源框2（VSX2）增強綠色熒光蛋白（eGFP）報告基因的人誘導多能干細胞系（hiPSCs）。方法根據(jù)成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關蛋白9（CRISPR/Cas9）技術原理,設計VSX2的小向導RNA（sgRNA）,構建敲除質粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供體質粒;2個質粒經(jīng)測序鑒定后電轉野生BC1-hiPSCs細胞系,采用嘌呤霉素篩選獲得單克隆,擴增培養(yǎng)并鑒定。采用PCR和Sanger測序鑒定基因型;采用核型分析法分析報告細胞系核型;采用STR法排除細胞交叉污染;采用免疫熒光法及逆轉錄PCR法檢測報告細胞系的多能干細胞分子標志物的表達;通過體外三胚層形成實驗鑒定報告細胞系向三胚層分化的能力;應用3D視網(wǎng)膜類器官誘導技術獲得視網(wǎng)膜類器官,并采用免疫熒光染色法評價VSX2蛋白與eGFP的共定位情況。結果電轉后通過PCR鑒定和Sanger測序成功篩選到1株含有VSX2-eGFP報告基因的hiPSC系。核型分析結果顯示該報告細胞系核型正常。STR鑒定結果表明,BC1-VSX2eGFP-iPSCs無細胞系交叉污染。逆轉錄PCR檢測和免疫熒光染色表明,BC1-VSX... 

【文章來源】：中華實驗眼科雜志. 2020,38(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁


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