發(fā)布時(shí)間：2017-04-13 14:16

  本文關(guān)鍵詞：SIRT1調(diào)節(jié)人小梁網(wǎng)細(xì)胞COL1A1的作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是指由于病理性高眼壓引起特征性視盤損害和視野缺損,而且眼壓升高時(shí)前房角開放的一種青光眼。目前,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。其中,小梁網(wǎng)細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)異常積聚是造成房水流出受阻、眼壓升高的關(guān)鍵因素。因此,尋求解決小梁網(wǎng)細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積這一科學(xué)問題的途徑成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)。組蛋白和非組蛋白去乙�；窼IRT1(sirtuin 1)在其他疾病研究中有抗纖維化、抗氧化等作用,另外SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇具有降低眼壓的作用。我們推測(cè)SIRT1在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中可能發(fā)揮抑制細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積的作用。另外,有研究顯示,SIRT1與轉(zhuǎn)錄因子HES1(hes family bHLH transcription factor 1)蛋白之間有相互作用,并且HES1可能直接參與COL1A1(collagen type 1α1)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。故本課題希望在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中證實(shí)SIRT1-HES1-COL1A1途徑的存在,以闡明SIRT1作為青光眼治療靶點(diǎn)的作用機(jī)制。方法:利用免疫熒光技術(shù)探索SIRT1在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及定位。利用SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇不同濃度(0,10,25,50μM)分別處理人小梁網(wǎng)細(xì)胞12 h。利用Western Blot及qPCR分別檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)SIRT1轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的影響,并同時(shí)分析白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)COL1A1表達(dá)的影響。利用病毒感染的方法,在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)SIRT1的敲低或者過表達(dá),Western Blot及qPCR檢測(cè)SIRT1敲低及過表達(dá)的效果,同時(shí)檢測(cè)SIRT1敲低及過表達(dá)對(duì)COL1A1表達(dá)的影響。利用病毒感染的方法,在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中敲低HES1,Western Blot及qPCR檢測(cè)HES1敲低效率,并同時(shí)檢測(cè)HES1對(duì)COL1A1的正向調(diào)控作用。利用SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇不同濃度(0,10,25,50μM)分別處理人小梁網(wǎng)細(xì)胞,作用時(shí)間12h。利用Western Blot及qPCR分別檢測(cè)白藜蘆醇激動(dòng)SIRT1后對(duì)HES1表達(dá)的影響。通過病毒感染,在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)SIRT1的敲低或者過表達(dá),Western Blot及qPCR檢測(cè)SIRT1敲低及過表達(dá)對(duì)HES1表達(dá)的影響。ChIP實(shí)驗(yàn)及DNA pull-down實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)SIRT1敲低后HES1與COL1A1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的情況。最后,利用300μM過氧化氫刺激人小梁網(wǎng)細(xì)胞2h,建立氧化應(yīng)激模型。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,Western Blot檢測(cè)SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇及過表達(dá)SIRT1對(duì)COL1A1的調(diào)控作用。結(jié)果:免疫熒光結(jié)果顯示,SIRT1在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中表達(dá),并且只分布在人小梁網(wǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核中。SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中激活SIRT1的蛋白表達(dá),并且可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分COL1A1的合成。在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中敲低SIRT1,COL1A1表達(dá)上調(diào),而過表達(dá)SIRT1,COL1A1表達(dá)下調(diào)。在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中抑制HES1蛋白能降低COL1A1的表達(dá),即驗(yàn)證了HES1對(duì)COL1A1的正向調(diào)控作用。過表達(dá)SIRT1可以下調(diào)HES1的表達(dá),抑制SIRT1可上調(diào)HES1的表達(dá),另外,ChIP實(shí)驗(yàn)及DNA pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制SIRT1后,HES1在COL1A1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)富集量增加。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,SIRT1表達(dá)水平下調(diào),COL1A1及HES1表達(dá)水平上調(diào)。另外,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,抑制HES1可以下調(diào)COL1A1的表達(dá),過表達(dá)SIRT1及利用SIRT1的激動(dòng)劑白藜蘆醇可下調(diào)HES1及COL1A1的表達(dá)。結(jié)論:1.SIRT1可以負(fù)向調(diào)控COL1A1合成;HES1可以正向調(diào)控COL1A1合成。2.抑制SIRT1可以上調(diào)HES1與COL1A1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。3.氧化應(yīng)激狀態(tài)下,SIRT1可以依賴HES1從而調(diào)控COL1A1的表達(dá)。白藜蘆醇通過激活SIRT1下調(diào)HES1及COL1A1的表達(dá),從而可能達(dá)到降眼壓的效果。
【關(guān)鍵詞】：小梁網(wǎng)細(xì)胞 SIRT1 白藜蘆醇 膠原蛋白1型 HES1
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R775.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號(hào)說明10-14
• 前言14-19
• 研究現(xiàn)狀、成果14-16
• 研究目的、方法16-19
• 一、SIRT1調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)成分COL1A1的生成19-43
• 1.1 對(duì)象和方法19-35
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象19
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑19-24
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法24-35
• 1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法35
• 1.2 結(jié)果35-39
• 1.2.1 SIRT1在正常HTMCs中的定位35
• 1.2.2 SIRT1激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)生成的影響35-37
• 1.2.3 過表達(dá)SIRT1對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)生成的影響37-38
• 1.2.4 敲低SIRT1對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)COL1A1的影響38-39
• 1.3 討論39-41
• 1.4 小結(jié)41-43
• 二、SIRT1調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)COL1A1生成機(jī)制研究43-61
• 2.1 對(duì)象和方法43-49
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象43
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑43-45
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法45-49
• 2.2 結(jié)果49-56
• 2.2.1 抑制HES1上調(diào)COL1A1的表達(dá)49-50
• 2.2.2 SIRT1激動(dòng)劑抑制HES1的表達(dá)50-51
• 2.2.3 過表達(dá)SIRT1下調(diào)HES1的表達(dá)51-52
• 2.2.4 抑制SIRT1上調(diào)HES1的表達(dá)52
• 2.2.5 抑制SIRT1上調(diào)HES1與COL1A1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合52-54
• 2.2.6 氧化應(yīng)激狀態(tài)下SIRT1的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)生成的影響54-56
• 2.3 討論56-60
• 2.4 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61
• 展望及不足之處61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明69-70
• 綜述 SIRT1與氧化應(yīng)激相關(guān)研究進(jìn)展70-78
• 綜述參考文獻(xiàn)74-78
• 致謝78-80
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷80

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本文編號(hào)：303797