發(fā)布時間：2021-01-14 05:46

　　目的:血視網(wǎng)膜屏障（blood retinal barrier BRB）類似于血腦屏障（Blood Brain Barrier BBB）,都具有選擇通透性。位于視網(wǎng)膜組織和血液之間。對維持視網(wǎng)膜微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。大部分視網(wǎng)膜疾病都可以引起B(yǎng)RB的損傷,包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞和視網(wǎng)膜脫離等。大量研究表明氧化應激產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）會導致細胞的變性和壞死。視網(wǎng)膜血管內皮細胞作為BRB重要組成部分,其ROS的主要來源是4型NADPH氧化酶（NOX4）。所以我們研究NOX4干擾,能否減少ROS的產(chǎn)生,減輕實驗性視網(wǎng)膜脫離大鼠BRB的損傷,減少光感受器細胞的壞死,從而保護大鼠視功能。從而為我們視網(wǎng)膜脫離患者視功能的保護提供有效的治療思路。方法:（1）構建并篩選NOX4干擾重組腺相關病毒2（AAV2）質粒并且包裝測定病毒滴度。熒光顯微鏡下觀察AAV2載體轉染PC-12細胞系的效率。（2）腺相關病毒載體視網(wǎng)膜下腔注射轉染大鼠視網(wǎng)膜,3周后取大鼠視網(wǎng)膜制作冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察病毒轉染大鼠視網(wǎng)膜情況,每只大鼠右眼做實驗組,左眼作為對照組。（3）AAV2載體轉染視網(wǎng)膜3周... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

表達GFP綠色熒光的AAV2載體可以在體外有效轉染大鼠PC-12細胞系，以上所有圖片標尺都是40μm

圖 2：以 AAVNC 為校準,NOX4 基因相對于 RGAPDH(內參Figure 2: Histgram of relative expression quantity of NRGAPDH(internal reference), calibrated byAAVNC.如圖 2 所示，相對于空白對照和轉染了陰性干擾病毒，NOX4-rat-578 、 NOX4-rat-1207 的 細 胞 中 NOX4 基 因 NOX4-rat-1207 的干擾效果做好，所以我們選用 NOX4-rat-1體內實驗。最終選擇的 NOX4-rat-1207 病毒滴度為 1.12x101病毒滴度為 3.99x1010V.G./ml。大鼠視網(wǎng)膜下腔注射 AAV2 載體轉染視網(wǎng)膜，3 周后取冰凍切片，檢測病毒轉染大鼠視網(wǎng)膜效率。如圖 3：

圖 3：表達 GFP 綠色熒光的 AAV2 載體視網(wǎng)膜下腔注射，可以在體內有效轉染大鼠視網(wǎng)膜組織，視網(wǎng)膜下注射后三周達到最大轉染效率，圖片標尺為 40μm。Figure 3: Subretinal injection of AAV2 virus vector expressing green fluorescence ofGFP could effectively transfection the retinal tissue of rats in vivo, and the maximumtransfection efficiency was reached three weeks after subretinal injection.scalebar=40μm如圖 3 所示，大鼠視網(wǎng)膜下腔注射 AAV2 病毒 3 周后，取大鼠的視網(wǎng)膜組織做冰凍切片，在倒置熒光顯微鏡下使用藍光和紅光觀察 GFP 熒光和 DAPI 染色�？梢杂^察到大部分視網(wǎng)膜可以被病毒有效的轉染，光感受器細胞層檢測到較強的GFP 熒光表達，余下各層均有表達，較光感受器細胞層少。


本文編號：2976334