發(fā)布時(shí)間：2017-04-09 08:04

  本文關(guān)鍵詞：探討熊果酸對(duì)大鼠同種異體角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)是由多種免疫細(xì)胞和免疫分子共同參與的復(fù)雜的免疫反應(yīng)過(guò)程。雖然角膜自身具有前房相關(guān)性免疫偏離與免疫赦免的特點(diǎn),但移植術(shù)后的排斥反應(yīng)仍是造成角膜移植失敗的主要原因。長(zhǎng)期以來(lái),防治免疫排斥反應(yīng)成為研究角膜移植的重要方向。目前臨床上普遍采用的非特異性免疫抑制療法,只是“治標(biāo)”的方法,療效有限且毒副作用大。近年來(lái),應(yīng)用某些藥物可以更有效抑制角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生,從而延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間,成為研究角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)的方向之一。研究背景熊果酸,又名烏索酸、烏蘇酸、α-香樹(shù)脂醇,是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物,能夠從多種天然植物提取的功能成分。純品一般為白色針狀結(jié)晶(乙醇中結(jié)晶),味略微苦,基本骨架是由多氧蒎的五環(huán)母核所構(gòu)成的。化學(xué)名3-Hydroxy-12-ursen-28-oic acid,分子式C30H11803,相對(duì)分子質(zhì)量456.68,熔點(diǎn)285-291℃,可溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮,略溶于丙酮,微溶于苯、氯仿、乙醚,易溶于二氧六環(huán)、吡啶,不溶于水和石油醚。熊果酸不僅僅對(duì)多種惡性腫瘤的增殖具有明顯的細(xì)胞毒作用,而且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分化及抑制新生血管的形成,還對(duì)多種致癌促癌物質(zhì)造成的細(xì)胞癌變具有抵抗作用。另一方面,能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮細(xì)胞形成,有抗菌、抗糖尿病、抗新生血管、抗?jié)儭⒔档脱�、抗組織氧化及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物學(xué)作用和藥理活性。在角膜移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)過(guò)程中,主要是由CD4Th1細(xì)胞起作用的。核因子NF-κB是一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強(qiáng)子KB序列特異結(jié)合的蛋白因子,是在B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn),不僅能夠大量存在于真核細(xì)胞內(nèi),而且能夠與多種細(xì)胞基因的啟動(dòng)子序列或增強(qiáng)子序列的特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合,從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。另外,NF-κB在炎癥、腫瘤、過(guò)敏反應(yīng)等疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用,能夠與細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡,以及炎癥、免疫應(yīng)答反應(yīng)等重要的病理生理過(guò)程緊密聯(lián)系。NF-κB可上調(diào)T細(xì)胞表面B7共刺激分子與MHC-Ⅱ勺表達(dá),刺激Thl細(xì)胞因子IL-2與IFN-γ的產(chǎn)生。熊果酸抑制NF-κB的活性,從而下調(diào)IL-2、IFN-γ分子的表達(dá)情況,延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間。熊果酸是通過(guò)PKC-lκ-Bα-NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)免疫抑制的,抑制IK-Ba磷酸化和核因子NF-KBp65核轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致由PKC磷酸化的NF-κB活化抑制。NF-κB是炎癥和免疫反應(yīng)過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、增殖與基因轉(zhuǎn)錄。由p50、p65兩個(gè)異質(zhì)二聚體構(gòu)成,與抑制亞基單位Iκ-Bα結(jié)合,存在于未活化狀態(tài)的胞液中。通過(guò)Iκ-B激酶,使抑制亞基單位κ-Bα的絲氨酸32、36部位磷酸化,磷酸化的作用在于泛素化與降解。Iκ-Bα降解可導(dǎo)致活化單位的p50、p65的釋放并結(jié)合到細(xì)胞核,結(jié)合到特定的啟動(dòng)子區(qū)域,編碼炎癥細(xì)胞因子。另外,熊果酸可明顯抑制新生血管的生成,減輕免疫排斥的炎癥反應(yīng)；降低由CD3/CD8誘導(dǎo)的T細(xì)胞表面標(biāo)志CD25、CD69與IL-2的表達(dá)含量,抑制NF-κB核因子轉(zhuǎn)錄與T細(xì)胞活性,而非通過(guò)上調(diào)CD4 CD25 Foxp3T細(xì)胞,誘導(dǎo)宿主的特異性免疫耐受；能夠抑制B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活化,增殖與細(xì)胞因子的分泌。抑制絲裂霉素誘導(dǎo)的ERK、JNK的磷酸化與免疫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、 NF-AT與AP-1的活化,明顯降低IL-2、IL-4、IL-6及IL-17的含量,降低T細(xì)胞表面CD25、CD69、CD134、CD80及CD86的含量；呈劑量依賴性地抑制T細(xì)胞的活化與增殖,能夠明顯降低T細(xì)胞表面活性標(biāo)志CD25、CD69與CD71的含量,降低NF-κB的表達(dá),從而抑制T細(xì)胞活性。因此,本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用“熊果酸抑制NF-κB的活性,延長(zhǎng)角膜移植存活時(shí)間”方案,經(jīng)腹腔內(nèi)注射至同種異體大鼠角膜移植模型(SD→Wistar)的受體體內(nèi),探討熊果酸對(duì)誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受的影響,為臨床進(jìn)行有效治療、抑制角膜移植術(shù)后的排斥反應(yīng)提供重要的理論依據(jù)。材料與方法1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供體為SD大鼠；受體為Wistar大鼠。鼠齡6-8周,體重180-220g,雌性。分4組：A：空白對(duì)照組(n=8)；B：自體角膜移植組(n=8)；C：同種異體角膜移植組；D：熊果酸組(n=8),建立大鼠同種異體角膜移植模型,術(shù)后觀察角膜移植排斥反應(yīng)及按Larkin等人評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,術(shù)后14天取材。2、病理組織切片HE染色術(shù)后第14天,分別于各組中取大鼠角膜植片進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè),標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋,制備成5μm厚的連續(xù)切片,經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察角膜植片病理學(xué)變化。3、Real Time PCR (RT-PCR)檢測(cè)取大鼠角膜,置于1mL Trizol的離心管中,采用Trizol一步法提取總RNA,行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；以焦碳酸二乙酯(DEPC)水為空白對(duì)照,應(yīng)用Nanodrop測(cè)定RNA濃度,同時(shí)記錄各組的RNA濃度及其OD260/OD280值；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū),逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。提取的DNA樣品直接用于qPCR實(shí)驗(yàn)或者-20℃保存。引物序列為：GAPDH上游：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'下游：5'-TCCACCACCCT GTTGCTGAT-3'IL-2上游：5'-TGATGGACCTACAGGAGCTCCTGAG-3'下游：5'-GAGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3'VEGF上游:5'-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3'下游：5'-TGAACTTCACCACTTGGCAT-3'IFN-γ上游:5'-GGAGGAACTGGCAAAAGGATGGT-3'下游：5'-TTGGGACAATCTCTTCCCCAC-3'ICAM-1上游：5'-GCTACATCCACACTGACGCT-3'下游：5'-CAGGGAATGAGTAGACCTCCA-3'NF-KBp65上游：5'-CCGTGGAGTACGACAACATC-3'下游：5'-CCTCTTCCAGCTGCTATGTG-3'RT-PCR反應(yīng)體系如下：反應(yīng)總體積(Total)為20μl:SYBR@ (R) PrimxEx Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2x) 10.0μl, PCR Forward Prime (10μM) 0.8μl、PCR Reverse orword Prime (10μM) 0.8μl、ROX reference Dye (50x)、DNA模板2μ1、dH2O(滅菌蒸餾水)6μ1。反應(yīng)條件：95℃30s預(yù)變性,95℃5s,60℃34s,40個(gè)循環(huán),重復(fù)3次。4、Western Blotting檢測(cè)取大鼠角膜植片,采用冰凍的RIPA裂解液裂解角膜組織,PBS緩沖液進(jìn)行洗滌,加入蛋白酶抑制劑,提取核蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；室溫下用封閉液(5%脫脂奶)封閉1h；兔抗NF-κBp65多克隆抗體、兔抗IκB-α多克隆抗體(1：4000),鼠抗ICAM-1單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜；洗滌與封閉后,與相應(yīng)的Ⅱ抗(1：10000)結(jié)合,定影、顯影、曝光,化學(xué)發(fā)光法顯示免疫條帶。GAPDH作為內(nèi)參抗體。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。應(yīng)用Kaplan-Meier檢驗(yàn)比較各組植片的平均存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x±s表示,所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后,采用單因素方差分析及兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.與同種異體角膜移植組相比,熊果酸組的角膜植片存活時(shí)間明顯延長(zhǎng),P0.05,兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.各組(正常對(duì)照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組及熊果酸組)取眼球組織行病理組織切片檢查,結(jié)果顯示：正常角膜組織結(jié)果清楚,未見(jiàn)異常；自體角膜移植組中角膜各層結(jié)構(gòu)清楚,未見(jiàn)明顯異常,僅基質(zhì)層中見(jiàn)少量新生血管與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；同種異體角膜移植組角膜各層組織中大量單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),基質(zhì)層可見(jiàn)新生血管形成,部分新生血管的管腔中亦可見(jiàn)散在的少量淋巴細(xì)胞；熊果酸組的角膜結(jié)構(gòu)基本保持正常,植片基質(zhì)層僅有個(gè)別淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),植床處可見(jiàn)少量新生血管。3.各組(正常對(duì)照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組及熊果酸組)取角膜移植片行RT-PCR檢測(cè),各組角膜植片中NF-KBp65, IL-2, VEGF, IFN-y, ICAM-1的相對(duì)含量(RQ值表示)在mRNA水平上有差異,B組、C組在角膜移植術(shù)后,IL-2, IFN-γ, NF-κBp65, VEGF, ICAM-1的含量會(huì)明顯升高,D組,即熊果酸組,用藥之后,相應(yīng)的炎癥指標(biāo)明顯下降。應(yīng)用單因素方差分析,先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),F值依次為236.991,414.224,24.931,32.164,21.383,采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,正常組與自體角膜移植組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C組與D組之間,NF-κBp65的相對(duì)含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.各組(正常對(duì)照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組及熊果酸組)取角膜移植片行Western Blotting檢測(cè),各組角膜植片中NF-κBp65,IκB-α的相對(duì)含量(用1A表示)在蛋白表達(dá)水平上有所差異,自體角膜移植組、熊果酸組在角膜移植術(shù)后,NF-κBp65,κB-α的相對(duì)含量變化趨勢(shì)一致；與同種異體角膜移植組相比,熊果酸組NF-κBp65的相對(duì)含量明顯下降,而κB-α的含量升高。結(jié)論1.同種異體大鼠角膜移植術(shù)后,熊果酸組角膜植片的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)；病理組織切片顯示：熊果酸組的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與新生血管情況,均較同種異體角膜移植組明顯好轉(zhuǎn)；說(shuō)明熊果酸對(duì)移植術(shù)后排斥反應(yīng)具有一定的抑制作用。2.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：在mRNA水平上,各組角膜植片中IL-2、IFN-γ、 NF-κBp65、VEGF、ICAM-1的相對(duì)含量有差異,用藥之后,相應(yīng)的炎癥指標(biāo)明顯下降；Western Blotting檢測(cè)結(jié)果表明,熊果酸組NF-KBp65的相對(duì)含量明顯下降,而κ-Bα的含量升高,熊果酸可能通過(guò)抑制NF-κB通道蛋白的表達(dá),抑制角膜移植排斥反應(yīng)的。因此,本實(shí)驗(yàn)為熊果酸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 角膜移植 穿透性 熊果酸 排斥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R779.65
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-23
• 第一部分 大鼠同種異體角膜動(dòng)物模型建立及術(shù)后排斥反應(yīng)情況的觀察23-34
• 1. 材料24-25
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24
• 1.2 主要試劑24
• 1.3 主要儀器及器械24-25
• 2. 方法25-27
• 2.1 排斥反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)25-26
• 2.2 術(shù)后排斥反應(yīng)的觀察26-27
• 3. 結(jié)果27-30
• 4. 討論30-34
• 第二部分 大鼠角膜植片組織病理學(xué)檢查、熒光定量PCR檢測(cè)與WESTERN BLOTTING檢測(cè)及結(jié)果分析34-53
• 1. 材料34-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象34
• 1.2 主要試劑34
• 1.3 主要儀器34-35
• 2. 方法35-42
• 2.1 組織病理學(xué)35-36
• 2.2 熒光定量PCR36-37
• 2.3 Western Blotting檢測(cè)37-42
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法42
• 3. 結(jié)果42-47
• 3.1 組織病理學(xué)結(jié)果42-43
• 3.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果43-45
• 3.3 Western-Blotting檢測(cè)45-47
• 4. 討論47-53
• 4.1 IL-2與角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)系48-49
• 4.2 IFN-γ與角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)系49
• 4.3 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)系49-50
• 4.4 VEGF與角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)系50-51
• 4.5 ICAM-1與角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)系51-52
• 4.6 熊果酸與角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)系52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 全文小結(jié)60-61
• 綜述61-69
• 參考文獻(xiàn)66-69
• 縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表69-70
• 研究成果70-71
• 致謝71-72

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王博;吳京;馬明;李萍萍;于健;;熊果酸對(duì)大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的抑制作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年04期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王海鷹;靈芝多糖通過(guò)TLR信號(hào)通路對(duì)糖尿病角質(zhì)形成細(xì)胞的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 方琨;弓形蟲(chóng)C-18、MIC11、PI等體內(nèi)外差異表達(dá)基因?qū)F-κB信號(hào)通路的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 唐媛媛;弓形蟲(chóng)Chinese1基因型蟲(chóng)株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞偏移應(yīng)答的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

3 周琨;CCR7基因修飾未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究[D];石河子大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：探討熊果酸對(duì)大鼠同種異體角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：294789