目的：觀察玻璃體切除術(shù)后微環(huán)境的改變對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞線粒體活性氧、膜電位、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及Caspases-3表達(dá)的影響及茶多酚眼用凝膠干預(yù)后的變化，研究玻璃體腔微環(huán)境的改變對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞的影響及茶多酚眼用凝膠的干預(yù)作用，闡明玻璃體切除術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制及茶多酚眼用凝膠的效果。 方法：1.體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細(xì)胞(Rabbit lens epithelial cells，RLECs)，分別采用BSS、硅油、O_2、C_3F_8制成特殊用途選擇培養(yǎng)基，模擬體內(nèi)玻璃體切除術(shù)后條件，加入不同濃度的茶多酚眼用凝膠進(jìn)行干預(yù)，觀察玻璃體腔微環(huán)境的改變對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)的變化。2.配制含終濃度分別為1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0μg/ml茶多酚眼用凝膠的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細(xì)胞，通過CCK-8法篩選出適合細(xì)胞生長(zhǎng)的茶多酚眼用凝膠的安全濃度。3.實(shí)驗(yàn)分為四組：A組(正常RLECs)-正常組，B組(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8)-對(duì)照組，C組(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8+10μg/ml茶多酚眼用凝膠)，D組(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8+100μg/ml茶多酚眼用凝膠)。4.通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體活性氧、膜電位的情況，免疫熒光化學(xué)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達(dá)情況及免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspases-3蛋白表達(dá)變化，進(jìn)而研究玻璃體切除術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制及茶多酚眼用凝膠的效果。 結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡下見：體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞呈梭形或多邊形，單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界清楚。2. CCK-8法檢測(cè)顯示：(1)加入終濃度為1000μg/ml的茶多酚眼用凝膠組OD值明顯低于單純晶狀體上皮細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；(2)加入終濃度分別為100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的茶多酚眼用凝膠組與單純晶狀體上皮細(xì)胞組OD值未見明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8損傷模型建立后，倒置相差顯微鏡下觀察A~D組細(xì)胞見：A組細(xì)胞呈梭形或多邊形，單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界清楚。B組一些細(xì)胞體積縮小、變圓，折光性改變，細(xì)胞周圍見透亮圈；細(xì)胞核縮小，分裂為多個(gè)或出現(xiàn)核邊聚；培養(yǎng)液中出現(xiàn)圓形懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片。C~D組細(xì)胞呈梭形或多邊形，單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界清楚，少許細(xì)胞體積縮小、變圓，折光性改變，培養(yǎng)液中未出現(xiàn)圓形懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片。4.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下的上皮細(xì)胞線粒體活性氧產(chǎn)生增多，而應(yīng)用茶多酚眼用凝膠干預(yù)組活性氧的產(chǎn)生明顯減少。5.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下的上皮細(xì)胞線粒體膜電位降低；而茶多酚眼用凝膠干預(yù)組細(xì)胞線粒體膜電位升高。6.經(jīng)免疫熒光檢測(cè)，在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下晶狀體上皮細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的陽性率明顯降低，而應(yīng)用茶多酚眼用凝膠干預(yù)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的陽性率明顯升高。7.經(jīng)免疫組化檢測(cè)，在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下晶狀體上皮細(xì)胞中Caspases-3表達(dá)明顯，而應(yīng)用茶多酚眼用凝膠干預(yù)后Caspases-3表達(dá)明顯降低。 結(jié)論：玻璃體切除術(shù)后微環(huán)境的改變引發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，上皮細(xì)胞的凋亡是玻切術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生的原因之一，而茶多酚眼用凝膠能夠有效抑制上皮細(xì)胞線粒體活性氧水平，保護(hù)線粒體膜電位及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，降低細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末執(zhí)行酶Caspases-3表達(dá)水平，從而抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。保護(hù)晶狀體上皮細(xì)胞免受損害，維持其結(jié)構(gòu)和功能的正常，從而可能延緩玻切術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R779.6
【部分圖文】：

培養(yǎng)6d的RLECs (100×) 培養(yǎng)8d的RLECs (100×)培養(yǎng)10d的RLECs (100×) 培養(yǎng)14d的RLECs (100×)圖1-1 原代培養(yǎng)兔晶狀體上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)過程1.4.2 兔晶狀體上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)原代兔晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，在10~14d時(shí)可達(dá)到80%匯合狀態(tài)，可用作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。傳代后1w左右可再次傳代，傳至第5代時(shí)細(xì)胞開始發(fā)生轉(zhuǎn)化變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，呈梭形或見偽足向外伸展，此時(shí)不可作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。見圖1-2

6傳2代RLECs (200×) 傳5代RLECs (200×)圖1-2 傳代兔晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)過程1.4.3 CCK-8法檢測(cè)不同濃度茶多酚眼用凝膠對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞活性的影響顯示：第1組OD值明顯低于其他組，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異，P<0.05。見表1-1表1-1 不同濃度茶多酚眼用凝膠對(duì)RLECs活性的影響GROUP N OD 值第1組 5 0.031±0.0069*第2組 5 0.058±0.0137第3組 5 0.064±0.0077第4組 5 0.069±0.0077第5組 5 0.076±0.0093*表示與其他組比較P<0.051.5 討論并發(fā)性白內(nèi)障是玻璃體切除術(shù)后的一種常見并發(fā)癥，晶狀體上皮細(xì)胞是其主要靶位。通過體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細(xì)胞，改變培養(yǎng)條件，模擬體內(nèi)玻璃體腔微環(huán)境改變的特點(diǎn)，是研究玻切術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障重要而有效的手段。在無菌條件下分離出晶狀體前囊膜，經(jīng)適當(dāng)處理后置于合適的條件進(jìn)行培養(yǎng)，是晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。晶狀體上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)為克隆樣貼附型生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為扁平的多角形，其生長(zhǎng)特點(diǎn)為細(xì)胞之間緊密相靠、互相銜接，呈“鋪路石”狀，細(xì)胞多為單層，且存在接觸抑制和密度抑制現(xiàn)象。晶狀體的組織結(jié)構(gòu)可分為：晶狀體囊、晶狀體前囊上皮細(xì)胞、結(jié)合質(zhì)、晶狀體纖維、晶狀體懸韌帶[1]。晶狀體是一個(gè)獨(dú)特的器官

細(xì)胞變得稀疏。見圖2-1BSS培養(yǎng)4d的RLECs (200×) 硅油培養(yǎng)4d的RLECs (200×)O2培養(yǎng)4d的RLECs (200×) C3F8培養(yǎng)4d的RLECs (200×)圖2-1 BSS、硅油、O2、C3F8培養(yǎng)基中的兔晶狀體上皮細(xì)胞1.2.2 不同濃度茶多酚眼用凝膠對(duì)BSS、硅油、O2、C3F8培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞干預(yù)的影響B(tài)SS、硅油、O2、C3F8培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞，在含終濃度分別為10μg/ml、100μg/ml的茶多酚眼用凝膠培養(yǎng)基中，上皮細(xì)胞較好的保持了原有的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞之間緊密相靠，互相銜接，排列規(guī)則，較少出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、空泡和顆粒等，細(xì)胞未見稀疏。見圖2-2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 汪榮軍;;左氧氟沙星眼用凝膠的制備[J];安徽醫(yī)藥;2006年02期

2 刁雨輝;周建平;胡雄林;;眼用溫敏凝膠釋放度及其影響因素研究[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2008年06期

3 楊潔,高飛;活性氧與細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2002年04期

4 郭炎榮;;眼用凝膠劑臨床應(yīng)用概述[J];海峽藥學(xué);2008年04期

5 金甌;郁引飛;;左氧氟沙星地塞米松眼用凝膠的制備及質(zhì)量控制[J];海峽藥學(xué);2010年07期

6 孟祥云;;中藥凝膠劑的研究概況[J];黑龍江醫(yī)藥;2007年01期

7 龔楚良;黃志元;;復(fù)方熊膽眼用即型凝膠的制備和質(zhì)量控制[J];江西中醫(yī)藥;2009年07期

8 張俊明;李良;鄭國(guó)安;郭晟;丁琦;;復(fù)方熊膽眼用即型凝膠局部眼刺激性試驗(yàn)[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2009年23期

9 代龍;;珍珠明目眼用即型凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J];齊魯藥事;2008年12期

10 徐亞靜;胡容峰;尹輝;高宇;;加替沙星pH敏感眼用原位凝膠體外釋放的研究[J];中國(guó)生化藥物雜志;2010年02期

本文編號(hào)：2828886