發(fā)布時間：2020-09-17 12:14

　　 目的:體外提取人臍帶間充質干細胞源性微囊泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles,hUCMSCs-MVs)并觀察hUCMSCs-MVs對糖尿病大鼠糖尿病視網膜神經損傷(diabetic retinal neurodegeneration,DRN)的作用及機制。方法:本實驗分3部分,第1部分進行hUCMSCs傳代培養(yǎng),收集細胞培養(yǎng)上清液,利用超速離心法提取hUCMSCs-MVs,流式細胞儀、透射電鏡等研究方法對hUCMSCs-MVs進行形態(tài)學及免疫學表型鑒定;第2部分為體外實驗,實驗分為4組:A組為正常對照組,B組高糖培養(yǎng)組(RGCs培養(yǎng)基內含濃度為33 mmol/L葡萄糖),C組為正常RGCs與hUCMSC-MVs共培養(yǎng)組,D組為高糖環(huán)境下RGCs與hUCMSC-MVs共培養(yǎng)組。通過免疫抗體包被篩選法及免疫熒光雙染法對原代SD大鼠視網膜視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGCs)進行分離及鑒定,觀察hUCMSCs-MVs與RGCs的內化過程,CCK-8法、膜聯蛋白-碘化丙啶(AnnexinV-PI)法、實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative real time time-reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫印跡試驗(Western Blot,WB)等測定hUCMSCs-MVs對各組RGCs的活性及凋亡的影響及各組細胞內B-細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bax、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3基因水平及蛋白水平的相對表達量;第3部分為體內實驗,實驗分為4組:A組為正常對照組、B組為DM對照組、C組為正常對照+hUCMSCs-MVs玻璃體腔注射組、D組為DM+hUCMSCs-MVs玻璃體腔注射組。實驗方法為腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型,建模成功后8周各組行玻璃體腔內注射hUCMSCs-MVs,注射后觀察時間為4周。利用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察內層視網膜結構改變,原位末端轉移酶標記技術(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)觀察DR大鼠內層視網膜細胞凋亡情況,免疫熒光雙染法定性及定位磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)在視網膜內的表達情況,WB法測量目的蛋白JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、裂解Caspase-3(Cleaved Caspase-3)的相對表達量。結果:成功提取hUCMSCs-MVs,通過透射電子顯微鏡及流式細胞儀對hUCMSCs-MVs進行形態(tài)及免疫學鑒定,觀察到hUCMSCs-MVs直徑介于10~2-10~3nm,為圓形膜性囊泡樣結構,高表達hUCMSCs特異性蛋白CD44、CD29、CD73、CD105,陰性表達整合素(integrin,CD49f)、HLA class II(HLA-DR)及造血干細胞特異標記蛋白CD34、CD45。hUCMSCs-MVs的分泌效率為接種密度約1×10~5/ml、第2代-第4代(P2-P4)hUCMSCs培養(yǎng)上清液約300ml可提取蛋白質量約342.65?1.32μg的hUCMSCs-MVs。成功完成原代SD大鼠RGCs體外培養(yǎng)及鑒定,證明體外RGCs可與hUCMSCs-MVs良好內化。CCK-8及AnnexinV/PI雙染法檢測結果顯示,B組細胞活性低于A、C、D組,B組細胞凋亡率高于A、C、D組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。RT-PCR及WB檢測結果顯示,B、D組RGCs、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達量高于A、C組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),SNK-q組間比較結果顯示D組RGCs內Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量高于B組,B組Bax、Caspase-3及Cleaved-Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達量高于D組,差異均具有統(tǒng)計學意義。STZ誘導建立DM大鼠模型,建模成功8周后大鼠視網膜切片HE染色可見糖尿病性視網膜病變;玻璃體腔注射hUCMSCs-MVs后4周,觀察4組大鼠內層視網膜厚度改變,4組差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),SNK-q檢驗示B組內層視網膜厚度低于其余3組,D組視網膜厚度高于B組。4組大鼠內層視網膜TUNEL染色陽性(TUNEL~+)細胞表達率差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),SNK-q檢驗分析結果顯示B組大鼠內層視網膜內TUNEL~+細胞表達率高于其余各組,D組內層視網膜內TUNEL~+細胞表達率低于B組。免疫熒光定位結果顯示早期DR大鼠視網膜內JNK的活化主要內層視網膜GCL,merge熒光融合后可見表達于RGCs胞漿內。4組間視網膜p-JNK陽性(p-JNK~+)表達率差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),SNK-q檢驗結果顯示B組大鼠內層視網膜內p-JNK~+表達率高于其余各組,D組GCL內的p-JNK~+表達率低于B組。WB結果顯示4組間目標蛋白相對表達量差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),SNK-q檢驗結果顯示B組Bcl-2相對表達量低于其余3組,B組JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相對表達量高于其余3組,D組JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相對表達量高于D組。結論:體外hUCMSCs-MVs可通過降低高糖環(huán)境下RGCs凋亡相關蛋白的表達發(fā)揮對高糖環(huán)境下RGCs損傷的保護作用;玻璃體腔注射hUCMSCs-MVs可通過增加視網膜內Bcl-2表達、降低JNK/Bax/Caspase-3的表達及活化,降低早期DR大鼠RGCs凋亡及內層視網膜萎縮,發(fā)揮對DRN的保護作用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R774.1
【部分圖文】：

1：A-D 為光學顯微鏡下觀察 hUCMSCs 細胞傳代培養(yǎng)后 1d、3d、5d、7d 的細胞 1d 細胞基本貼壁，3-5d 細胞成長梭形或多角形，7d 細胞融合率為 80%（×200）.2 繪制 hUCMSCs 細胞生長動力曲線依據細胞培養(yǎng)天數及細胞吸光度值 A 繪制的細胞生長曲線，細胞接種天處于不同生長時期，即生長緩慢的潛伏期、斜率較大的生長期、呈平頂期。從生長曲線觀察，1-3 天 A 值緩慢增加，細胞呈現緩慢生長，為的潛伏期。3-5 天吸光度 A 值曲線斜率增加，細胞生長迅速，為細胞對。5 天后細胞生長曲線變得平坦，即細胞生長緩慢，為細胞增殖穩(wěn)定期取 hUCMSCs 細胞穩(wěn)定期即培養(yǎng) 5-7 天 的 hUCMSCs 培 養(yǎng)基MSCs-MVs（圖 1.2）。

圖 1.2：hUCMSCs 細胞生長曲線圖，X 軸為培養(yǎng)時間（天），Y 軸為吸光度（A）1.2.3 hUCMSCs-MVs 形態(tài)學鑒定透射電子顯微鏡下觀察 hUCMSCs-MVs，可見 3%磷鎢酸負染背景hUCMSCs-MVs 為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構，未見雙凹圓盤狀構，顆粒膜結構完整，直徑約為（102-103）nm，流式細胞儀檢測可hUCMSCs-MVs 顆粒峰值主要位于（102-103）nm 直徑范圍（圖 1.3）。圖 1.3： hUCMSCs-MVs 透射電子顯微鏡像及流式細胞儀檢測結果：透射電子顯微鏡像

圖 1.2：hUCMSCs 細胞生長曲線圖，X 軸為培養(yǎng)時間（天），Y 軸為吸光度（A）1.2.3 hUCMSCs-MVs 形態(tài)學鑒定透射電子顯微鏡下觀察 hUCMSCs-MVs，可見 3%磷鎢酸負染背景下hUCMSCs-MVs 為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構，未見雙凹圓盤狀結構，顆粒膜結構完整，直徑約為（102-103）nm，流式細胞儀檢測可見hUCMSCs-MVs 顆粒峰值主要位于（102-103）nm 直徑范圍（圖 1.3）。

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本文編號：2820706