【摘要】：背景:增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是一種嚴重的致盲性眼科并發(fā)癥,常繼發(fā)于孔源性視網(wǎng)膜脫離和眼球穿通傷等。同時,PVR也是視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗的最常見原因。其中,視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細胞發(fā)生的上皮—間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是PVR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制。在此過程中,RPE細胞的極性和細胞間連接消失,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維樣細胞并表達細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白,參與視網(wǎng)膜表面纖維膜組織的形成。由于EMT潛在的分子機制尚不清楚,臨床上對于PVR缺少有效的預(yù)防和治療手段。因此,探討并闡明RPE細胞在EMT過程中的關(guān)鍵分子機制和調(diào)控因素,具有重要的意義。自噬(autophagy)是一種高度保守的,經(jīng)溶酶體途徑降解細胞內(nèi)大分子和受損細胞器的過程,對于維持RPE細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。同時,自噬水平的異常變化與RPE細胞多種病理性改變有關(guān)。近年來,在多個組織和器官的纖維化過程中均觀察到自噬水平的變化,其在EMT中的調(diào)控作用也逐漸受到關(guān)注。然而,在RPE細胞中,自噬與EMT的關(guān)系及其調(diào)控機制尚不清楚。角蛋白(keratin,KRT)8是上皮細胞中含量最多的中間絲蛋白,也是成熟RPE細胞的標志物。最近研究發(fā)現(xiàn),KRT8不僅具有維持細胞形態(tài)等骨架蛋白的功能,而且通過多種翻譯后修飾(post-translational modifications,PTMs)方式,特別是磷酸化修飾,參與細胞生長、細胞遷移和細胞應(yīng)激等多種細胞活動。目前,尚無KRT8及其磷酸化對于RPE細胞EMT過程影響的研究報道,其與自噬之間的相互作用機制也有待進一步研究。本研究旨在探究自噬與KRT8磷酸化在RPE細胞EMT過程中的調(diào)控作用,以及兩者間可能存在的相互作用關(guān)系,為完善PVR的發(fā)病機制,以及臨床預(yù)防和治療PVR奠定基礎(chǔ)。方法:1、利用10ng/ml TGF-β2處理人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株(ARPE-19),相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,western-blot檢測EMT標志性蛋白α-SMA、fibronectin和collagenⅣ的表達水平。在此模型基礎(chǔ)上,westem-blot檢測自噬標志性蛋白LC3-II、Atg5-12、Beclin 1和p62的表達水平,共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3和mRFP-GFP-LC3的熒光水平。同時,利用自噬抑制劑Baf-A1預(yù)處理ARPE-19細胞,TGF-β2刺激后western-blot檢測LC3-Ⅱ表達水平的變化。此外,在TGF-β2刺激前加入自噬抑制劑(3-MA和Baf-A1)或轉(zhuǎn)染特異性siRNA(si-ATG5和si-BECN1)對ARPE-19細胞預(yù)處理,細胞劃痕實驗和western-blot分別檢測細胞遷移能力和EMT標志性蛋白表達水平的變化。2、在體外ARPE-19細胞EMT模型的基礎(chǔ)上,westem-blot檢測KRT8和p-KRT8表達水平,并在TGF-β2刺激前轉(zhuǎn)染si-KRT8,western-blot檢測EMT標志性蛋白表達水平。同時,分別對ARPE-19細胞自噬(3-MA、Baf-A1和si-ATG5)和KRT8及其磷酸化(si-KRT8)水平進行干預(yù),TGF-β2刺激后westem-blot檢測自噬標志性蛋白(LC3-Ⅱ和p62)、KRT8和p-KRT8的表達水平變化,并利用細胞免疫熒光進一步檢測細胞中p-KRT8的表達水平。最后,TGF-β2刺激前ARPE-19細胞分別轉(zhuǎn)染KRT8表達質(zhì)粒(KRT8-WT)和磷酸化失活質(zhì)粒(KRT8-S74A),westem-blot檢測自噬標志性蛋白表達水平,共聚焦顯微鏡觀察mRFP-GFP-LC3熒光水平,細胞免疫熒光檢測LC3B和LAMP2在細胞內(nèi)的共定位情況。3、收集臨床上PVR患者的視網(wǎng)膜增殖膜樣本,免疫熒光技術(shù)檢測其中KRT8和自噬標志性蛋白LC3B的表達情況。結(jié)果:1、TGF-β2可以誘導(dǎo)ARPE-19細胞表達EMT標志性蛋白α-SMA、fibronectin和collagenⅣ,并且細胞形態(tài)出現(xiàn)纖維化樣改變。同時,TGF-β2促使自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ、Atg5-12和Beclin 1表達增加,p62降解增加,細胞內(nèi)GFP-LC3熒光斑點增多;Baf-A1預(yù)處理可以進一步增加LC3-Ⅱ表達,且mRFP-GFP-LC3中黃色和紅色熒光斑點增多。另外,預(yù)先加入自噬抑制劑(3-MA和Baf-A1)或轉(zhuǎn)染特異性siRNA(si-ATG5和si-BECN1)干擾ARPE-19細胞自噬活性,明顯抑制TGF-β2誘導(dǎo)的細胞遷移能力增強和EMT標志性蛋白表達增多。2、TGF-β2可以促進ARPE-19細胞中p-KRT8表達增加,而不影響KRT8表達水平。同時,轉(zhuǎn)染si-KRT8可以抑制TGF-β2誘導(dǎo)的ARPE-19細胞EMT標志性蛋白表達增多。在TGF-β2刺激前,加入3-MA或轉(zhuǎn)染si-ATG5阻斷自噬起始階段,可以使ARPE-19細胞中p-KRT8表達減少,而加入Baf-A1阻斷自噬后期階段則進一步增加p-KRT8表達水平;轉(zhuǎn)染si-KRT8可以使LC3-Ⅱ表達增加,而p62降解減少。另外,相比KRT8-WT,轉(zhuǎn)染KRT8-S74A的ARPE-19細胞在TGF-β2刺激后LC3-Ⅱ表達增加,而p62降解減少,并且mRFP-GFP-LC3中黃色熒光斑點增多,LC3B和LAMP2共定位減少。3、免疫熒光結(jié)果顯示,視網(wǎng)膜增殖膜組織中KRT8和LC3B均有較高水平表達,并且兩者存在明顯的共定位。結(jié)論:1、TGF-β2可以同時誘導(dǎo)ARPE-19細胞發(fā)生EMT和自噬,調(diào)控自噬可以有效逆轉(zhuǎn)其EMT過程。2、TGF-β2可以促進ARPE-19細胞中KRT8的磷酸化,且KRT8磷酸化通過影響自噬過程中自噬小體—溶酶體的融合,間接參與調(diào)控EMT過程。3、在PVR患者視網(wǎng)膜增殖膜組織中KRT8和LC3B高表達且存在共定位,與體外實驗結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R774.1
【圖文】：

邐１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｊ３２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋細胞邋Ｏｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，提取細胞全逡逑蛋白進行ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測，結(jié)果顯示ＥＭＴ標志性蛋白ａ－ＳＭＡ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和逡逑ｃｏｌｌａｇｅｎｌＶ的表徶水平逐漸增加（圖１．１）。同時，ＡＲＰＥ－１９細胞在１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－ｐ２逡逑下分別作用２４ｈ和４８ｈ，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)刺激后細胞形態(tài)出現(xiàn)逡逑纖維化樣的改變，細胞變?yōu)殚L梭形，細胞間排列紊亂且松散（圖１．２）。上述結(jié)果逡逑表明，ＴＧＦ－Ｐ２可以誘導(dǎo)ＡＲＰＥ－１９細胞發(fā)生ＥＭＴ。逡逑ＴＧＦ－ｐ２逡逑Ｔｉｍｅ邐邐逡逑（ｈｒｓ）邋0邋２邐６邐１２邐２４逡逑＾ｍｍｒｎ邐ＶＮＰ邋ａ－ＳＭＡ邋（４２邋ｋＤａ）逡逑＿邐|r呡邋Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ邋（２６３邋ｋＤａ）逡逑—邐Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ＩＶ邋（２００邋ｋＤａ）逡逑ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ邋ＧＡＰＤＨ邋（３７邋ｋＤａ）逡逑圖１．１邋ＡＲＰＥ－１９細胞中ＥＭＴ標志性蛋白表達水平。逡逑１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－ｐ２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋細胞邋０ｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ逡逑分別檢測各時間點細胞中ａ－ＳＭＡ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和ｃｏｌｌａｇｅｎｌＶ的表達水平。ＧＡＰＤＨ逡逑作為蛋白上樣內(nèi)參對照。逡逑２３逡逑

１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｊ３２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋細胞邋Ｏｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ逡逑結(jié)果顯示自噬標志性蛋白ＬＣ３－ＩＩ、Ａｔｇ５－１２和Ｂｅｃｌｉｎｌ的表達水平逐漸增加，而自逡逑噬降解底物蛋白ｐ６２表達水平逐漸降低（圖１．３）。同時，為了在細胞內(nèi)直觀觀察逡逑自噬小體結(jié)構(gòu)，我們在ＡＲＰＥ－１９細胞中轉(zhuǎn)染ＧＦＰ－ＬＣ３Ｂ質(zhì)粒，并分別在Ｏｎｇ／ｍ丨和逡逑１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－Ｐ２下作用２４ｈ，結(jié)果顯示ＴＧＦ－Ｐ２刺激組平均每個細胞中綠色熒光斑逡逑點（自噬小體）數(shù)目顯著增加，大約是對照組的５倍（圖１．４）。逡逑２４逡逑

邐ＴＧＦ－（３２（２４ｈ）邐ＴＧＦ－ｐ２（４８ｈ）逡逑圖１．２邋ＡＲＰＥ－１９細胞形態(tài)變化。逡逑１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｐ２刺激ＡＲＰＥ－１９細胞Ｏｈ、２４ｈ和４８ｈ后，倒置相差顯微鏡分別逡逑記錄各時間點細胞的形態(tài)。圖中放大倍率＝４0ｘ。逡逑１．３．２邋ＡＲＰＥ－１９細胞ＥＭＴ過程中自噬水平變化逡逑１０ｎｇ／ｍｌ邋ＴＧＦ－Ｊ３２邋刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋細胞邋Ｏｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ邋和邋２４ｈ邋后，ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ逡逑結(jié)果顯示自噬標志性蛋白ＬＣ３－ＩＩ、Ａｔｇ５－１２和Ｂｅｃｌｉｎｌ的表達水平逐漸增加，而自逡逑噬降解底物蛋白ｐ６２表達水平逐漸降低（圖１．３）。同時，為了在細胞內(nèi)直觀觀察逡逑自噬小體結(jié)構(gòu)，我們在ＡＲＰＥ－１９細胞中轉(zhuǎn)染ＧＦＰ－ＬＣ３Ｂ質(zhì)粒，并分別在Ｏｎｇ／ｍ丨和逡逑１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－Ｐ２下作用２４ｈ，結(jié)果顯示ＴＧＦ－Ｐ２刺激組平均每個細胞中綠色熒光斑逡逑點（自噬小體）數(shù)目顯著增加，大約是對照組的５倍（圖１．４）。逡逑２４逡逑

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