本文關(guān)鍵詞：微生態(tài)環(huán)境對(duì)變應(yīng)性鼻炎發(fā)病及機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)又稱(chēng)為過(guò)敏性鼻炎,是指具有特異性體質(zhì)的人接觸特定的變應(yīng)原以后發(fā)生的鼻粘膜炎癥性疾病,這一病理過(guò)程主要是由IgE介導(dǎo),涉及多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)、以及其他多種細(xì)胞因子的參與和釋放[1]。主要臨床表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、清水樣涕及眼癢等癥狀[2]。隨著人們生活水平的提高,AR的發(fā)病率逐年增加,巨額的治療費(fèi)用給家庭和社會(huì)都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[3]。目前對(duì)于AR的治療以脫敏療法和對(duì)癥治療為主[4],但患者依從性差、癥狀控制易反復(fù),�？刹l(fā)哮喘,嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[2]。因此,有效防治AR意義重大。近期研究發(fā)現(xiàn),變應(yīng)性疾病在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率明顯高于其他欠發(fā)達(dá)國(guó)家[5],出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因無(wú)法單獨(dú)用種族差異或基因遺傳等因素解釋[6]。有學(xué)者認(rèn)為,生活環(huán)境中微生物多樣性的減少可能與某些免疫性疾病和慢性炎癥疾病的發(fā)病率升高有關(guān)[5],如特應(yīng)性皮炎和克羅恩病[7]。Strachan提出的“衛(wèi)生學(xué)說(shuō)”認(rèn)為,由于人類(lèi)生活環(huán)境的逐漸改善和對(duì)于自身周?chē)l(wèi)生條件越來(lái)越重視,導(dǎo)致了人體尤其是兒童時(shí)期接觸病原微生物的機(jī)會(huì)大大減少,使得兒童的免疫系統(tǒng)缺乏有效的刺激和調(diào)動(dòng),由此引發(fā)免疫系統(tǒng)對(duì)于某些本應(yīng)屬于人體內(nèi)環(huán)境的正常菌群產(chǎn)生過(guò)度反應(yīng),最終導(dǎo)致變應(yīng)性疾病發(fā)病率的升高[8]。那么AR的發(fā)生是否與鼻腔的微生態(tài)環(huán)境的改變有一定的關(guān)聯(lián)?AR患者鼻腔的微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了怎樣的改變?鼻腔微生態(tài)環(huán)境的改變?nèi)绾我餉R的發(fā)病?其機(jī)制是什么?為解答以上的問(wèn)題,我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究了微生態(tài)環(huán)境改變對(duì)小鼠AR發(fā)病率的影響;應(yīng)用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)AR患者和正常人鼻腔內(nèi)的菌群分布進(jìn)行分析;選擇篩選出的差異菌與誘導(dǎo)的人外周血未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)探索差異菌對(duì)ar的作用及機(jī)制。本研究揭示了鼻腔微生態(tài)環(huán)境與ar之間的關(guān)系,對(duì)進(jìn)一步研究ar的防治具有重要意義。本研究分三部分:第一部分探討微生態(tài)環(huán)境的改變對(duì)小鼠變應(yīng)性鼻炎(ar)發(fā)病率的影響方法:將60只新生的balb/c小鼠隨機(jī)分為2組,每組30只。一組置于超凈無(wú)菌環(huán)境(germ-free,gf,gf環(huán)境組),另一組置于無(wú)特定病原體環(huán)境(specificpathogen-free,spf,spf環(huán)境組)中飼養(yǎng)。2種環(huán)境中的小鼠再各分為模型組(20只)和對(duì)照組(10只)。2個(gè)模型組在6周齡時(shí)用卵清蛋白(ova)致敏并激發(fā),觀察其癥狀和體征并評(píng)分;于第9周末再次激發(fā)后取材,用蘇木精-伊紅染色法行鼻腔組織切片染色;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa法)檢測(cè)外周血血清中ige、ifn-γ和il-4濃度。結(jié)果:各組小鼠癥狀體征評(píng)分顯示,gf模型組中ar反應(yīng)陽(yáng)性體征的小鼠數(shù)量顯著高于spf模型組;蘇木精-伊紅染色顯示ar反應(yīng)陽(yáng)性小鼠鼻黏膜高度充血水腫,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),各模型組中ar反應(yīng)陰性的小鼠和對(duì)照組的小鼠鼻黏膜無(wú)異常形態(tài);嗜酸性粒細(xì)胞(eos)計(jì)數(shù)顯示ar反應(yīng)陽(yáng)性小鼠鼻黏膜內(nèi)eos明顯增多;elisa結(jié)果顯示ar反應(yīng)陽(yáng)性小鼠血清中ige、il-4濃度顯著升高(p0.05),ifn-γ濃度顯著降低(p0.05)。結(jié)論:gf環(huán)境中小鼠ar的發(fā)病率高于spf環(huán)境。第二部分應(yīng)用16srdna高通量測(cè)序技術(shù)探索ar患者與正常人群鼻腔微生態(tài)菌群的差異方法:在鼻內(nèi)鏡下用無(wú)菌咽拭子取8例ar患者及7例正常人鼻腔中鼻道分泌物,提取總的細(xì)菌全組dna,行16srdnav6區(qū)檢測(cè)。結(jié)果:測(cè)序后總共生成1,900.09mb的數(shù)據(jù),總共檢測(cè)的細(xì)菌范圍覆蓋35門(mén)、39綱、77目、179科、338屬和38種;通過(guò)分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)ar患者鼻腔內(nèi)菌群otu數(shù)量(3176±623.6)大于正常人群(1771±397.2);主成分分析顯示放線菌目、乳桿菌目和假單胞菌目在ar患者和正常人群鼻腔中的差異性最大;otu分析顯示解沒(méi)食子鏈球菌、奈瑟菌和噬鹽單胞菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著高于正常人群,且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001);棒狀桿菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著低于正常人群,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001);兩組樣本組內(nèi)比較顯示各組內(nèi)的細(xì)菌種類(lèi)及數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:ar患者與正常人群鼻腔微生態(tài)菌群存在顯著差異,解沒(méi)食子鏈球菌、奈瑟菌和噬鹽單胞菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著高于正常人群,假白喉棒狀桿菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著低于正常人群,鼻腔菌群失調(diào)可能與ar的發(fā)生有關(guān)。第三部分差異菌與未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)探索差異菌對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將第二部分實(shí)驗(yàn)中篩選出的ar患者與正常人群鼻腔中存在顯著性差異的菌種,即c(corynebacteriumpseudodipheriticum)和s(streptococcusgallolyticus),分別與誘導(dǎo)的人外周血來(lái)源的未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)后,觀察c、s對(duì)未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞的分化程度的影響。通過(guò)對(duì)th1/th2平衡因子的研究,探索c和s在ar發(fā)病中的分子學(xué)機(jī)制。方法:本研究分為idcs、c、cs、s和mdcs五組。應(yīng)用humancd14microbeads分選人外周血pbmc中的cd14+細(xì)胞,用未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)6d,誘導(dǎo)生成未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。idcs組應(yīng)用完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h;c、cs和s組分別將滅活的c、cs和s與人外周血誘導(dǎo)的未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)48h;mdcs組應(yīng)用tnf-α培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,刺激未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞向成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)五個(gè)組中樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子cd80和cd86的變化;應(yīng)用elisa技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液中il-12的分泌水平;應(yīng)用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察培養(yǎng)后各組的樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)。最后,將以上五組培養(yǎng)后的細(xì)胞與cd4+t淋巴細(xì)胞以1:20、1:10和1:5的比例共培養(yǎng)48h,應(yīng)用elisa法檢測(cè)培養(yǎng)液中ifn-γ和il-4的表達(dá)水平;應(yīng)用mtt法檢測(cè)cd4+t細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)s組中表達(dá)cd80和cd86的樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量較idcs、c和cs組均顯著增高,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);但與mdcs組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;elisa檢測(cè)的結(jié)果顯示,s組培養(yǎng)液中il-12的分泌水平較idcs、c和cs組均降低,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);但與mdcs組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)S組的細(xì)胞表面與mDCs組均有大量不規(guī)則樹(shù)突樣凸起,即典型的成熟狀態(tài)的樹(shù)突狀細(xì)胞。ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后的IFN-γ水平檢測(cè),iDCs組C組CS組S組mDCs組,且C組和S組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),各組組內(nèi)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;IL-4水平檢測(cè)iDCs組C組CS組S組mDCs組,且C組和S組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),各組組內(nèi)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MTT結(jié)果顯示S組較iDCs、C和CS組CD4+T淋巴細(xì)胞增殖顯著增加,且具有數(shù)量依賴(lài)關(guān)系,當(dāng)培養(yǎng)后的細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞以1:5的比例時(shí),CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖能力最高。結(jié)論:Streptococcus gallolyticus可促進(jìn)未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞向成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化,具有刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的能力;抑制CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的表達(dá)量,促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-4的表達(dá)量。Corynebacterium pseudodipheriticum可顯著抑制Streptococcus gallolyticus誘導(dǎo)的未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞向成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
【關(guān)鍵詞】：變應(yīng)性鼻炎 微生態(tài)環(huán)境 16S rDNA 樹(shù)突狀細(xì)胞 Streptococcus gallolyticus Corynebacterium pseudodipheriticum CD4+T淋巴細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R765.21
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-25
• 第一部分 微生態(tài)環(huán)境對(duì)小鼠變應(yīng)性鼻炎發(fā)病率的影響25-34
• 1 材料25-26
• 2 方法26-28
• 3 結(jié)果28-31
• 4 討論31-34
• 第二部分 變應(yīng)性鼻炎患者鼻腔微生態(tài)菌群的研究34-46
• 1 材料34-35
• 2 方法35-38
• 3 結(jié)果38-44
• 4 討論44-46
• 第三部分 差異菌對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響46-67
• 1 材料46-48
• 2 方法48-54
• 3 結(jié)果54-64
• 4 討論64-67
• 小結(jié)67-68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果73-74
• 致謝74-75

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本文編號(hào)：273757