【摘要】：目的:觀察在血糖波動的培養(yǎng)條件下,人視網(wǎng)膜色素上皮(ARPE-19)細胞內氧化應激及自噬水平的變化,研究氧化應激與自噬之間的相互關系,并進一步闡明其具體的作用途徑,為通過調控自噬治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR),提供理論基礎。方法:1.根據(jù)血糖濃度將細胞分別培養(yǎng)于正常(C)組、高糖(HG)組、波動(IHG)組及高滲(H)組,分別培養(yǎng)48h。噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力,觀察不同血糖濃度對細胞活力的影響。采用多種不同氧化應激試劑盒(活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)),檢測上述各組細胞內的氧化應激水平。2.血糖波動條件下,通過透射電鏡(TEM)觀察細胞內自噬體的形成情況。蛋白質免疫印跡(western blot,WB)法檢測細胞內自噬水平的變化及應用自噬阻斷劑:氯化銨(NH4Cl)前后,細胞內自噬通量的變化。WB法檢測應用抗氧化劑:N-乙酰半胱氨酸(NAC)前后,細胞內自噬水平變化,研究氧化應激與自噬間的關系。3.血糖波動條件下,細胞免疫熒光法觀察高遷移族蛋白1(HMGB1)在細胞內的分布情況。WB法檢測應用HMGB1阻斷劑:丙酮酸乙酯(EP)前后,細胞內自噬水平變化及ROS試劑盒檢測細胞內ROS水平變化。結果:1.細胞形態(tài):C組細胞細胞排列規(guī)律,表現(xiàn)為長梭形、三角形及少量不規(guī)則形,胞質內可見少量灰黑色顆粒;H組與C組相比并無明顯差異,而HG組及IHG組,細胞胞體變薄又瘦,形態(tài)多樣,不規(guī)則細胞明顯增多,且IHG組細胞變化更為明顯。2.細胞活力:異常高糖條件下的細胞活力呈現(xiàn)不同程度的下降,IHG組最明顯,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),而H組與C組相比無明顯差異(p0.05)。3.氧化應激:與C組相比,細胞的氧化應激水平,在H組及IHG組明顯升高,表現(xiàn)為兩組ROS、MDA水平明顯升高,SOD水平降低,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),而H組差異均無統(tǒng)計學意義(p0.05)。IHG組與HG組相比,ROS、MDA水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),而SOD差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。4.自噬:TEM:IHG組細胞內自噬體明顯多于C組。蛋白表達:與C組相比,自噬相關蛋白LC3表達明顯升高,而p62蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。NH4Cl預處理后,LC3表達降低,而p62表達升高,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。NAC預處理后,LC3表達降低,而p62表達升高,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。5.免疫熒光:細胞內HMGB1從細胞核釋放到胞漿,IHG組明顯多于C組,熒光顯微鏡下,胞漿內可見點狀綠色強熒光。EP預處理后,細胞LC3蛋白表達水平明顯降低,而p62表達升高,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。同時,細胞內ROS水平升高,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:1.異常的高糖環(huán)境能夠造成ARPE-19細胞的損傷,尤其是血糖波動造成的損傷更為明顯。2.血糖波動條件下,ARPE-19細胞的氧化損傷水平明顯升高,氧化損傷能夠誘導細胞自噬的發(fā)生。3.血糖波動條件下,ARPE-19細胞通過HMGB1途徑啟動自噬,自噬啟動后能夠降低細胞內的氧化損傷水平,故對細胞起到保護作用
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R774.1

【參考文獻】

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1 余芳;朱惠平;;2型糖尿病患者血糖波動與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關性研究[J];醫(yī)學臨床研究;2012年08期

2 常東;潘洪志;許風娟;馮磊光;李輝;匡紅宇;盧明俊;;糖尿病及其視網(wǎng)膜病變患者抗氧化酶及氧化應激產(chǎn)物的變化[J];哈爾濱醫(yī)科大學學報;2008年05期

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本文編號：2576000