發(fā)布時間：2019-11-26 16:03

【摘要】：目的：探討脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, AMSC)聯(lián)合類內(nèi)皮細胞(endothelial-like cell, ELC)或人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)移植對糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)大鼠的血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的影響及作用機制；評價不同劑量的AMSC移植治療DR大鼠的效果。方法：以鏈脲佐菌素腹腔注射法建立Wistar大鼠糖尿病動物模型。于注射后7個月(30周)時,隨機抽選大鼠行視網(wǎng)膜血管網(wǎng)消化鋪片以明確DR血管性損傷的發(fā)生。原代分離、培養(yǎng)AMSCs和HUVECs,流式細胞儀進行鑒定。將AMSCs置于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化得到ELCs。DR大鼠隨機分組：未治療組、誘導(dǎo)組(AMSCs +ELCs)、聯(lián)合組(AMSCs+HUVECs)、高劑量組(AMSCs)及低劑量組(AMSCs),經(jīng)尾靜脈注射行細胞干預(yù)。于干預(yù)后2、4周,Evans blue滲漏實驗評估大鼠的BRB功能；HE染色評估大鼠視網(wǎng)膜水腫度；qPCR及Western-blot檢測大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2)的表達；免疫組織化學(xué)及共聚焦熒光染色觀察移植細胞向視網(wǎng)膜的歸巢；心、肝、脾、胰、腎的HE及免疫組織化學(xué)染色評估細胞移植的安全性。結(jié)果：1)DR模型：7個月時,糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)消化鋪片可見閉鎖的無細胞性毛細血管,DR大鼠模型建成。2)細胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的AMSCs及誘導(dǎo)而來的ELCs均為成纖維細胞樣。原代培養(yǎng)的HUVECs為鋪路石樣排列的多角形細胞,高表達內(nèi)皮細胞標(biāo)志分子CD31(99.52%)和vWF(99.63%)。3) BRB功能試驗：干預(yù)后2周,與未治療組相較,僅誘導(dǎo)組及低劑量組的Evans blue滲漏量有所減輕,BRB功能有改善。干預(yù)后4周,其余各干預(yù)組的BRB功能均較誘導(dǎo)組的為好。3) 分子表達：干預(yù)后2周,與未治療組相較,僅低劑量組的ICAM-1蛋白水平有所下降；誘導(dǎo)組的ICAM-1及VEGF的基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄及蛋白表達均有所上升；各組之間Ang-2的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達均無統(tǒng)計學(xué)差異。干預(yù)后4周,與未治療組相較,各干預(yù)組的ICAM-1蛋白表達均有所下降；低劑量組的VEGF的基因轉(zhuǎn)錄水平有所上升,但VEGF蛋白表達有所下降；誘導(dǎo)組的VEGF的基因轉(zhuǎn)錄水平有所上升,蛋白水平無明顯變化；各組之間Ang-2的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。4)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)：標(biāo)化灰度值分析結(jié)果示,干預(yù)后2周,與未治療組視網(wǎng)膜對應(yīng)層次對比,僅低劑量組的外核層和視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫度有所減輕。干預(yù)后4周,與未治療組視網(wǎng)膜對應(yīng)層次相較,各干預(yù)組的外核層、除外誘導(dǎo)組的各干預(yù)組的內(nèi)核層、聯(lián)合組及高劑量組的內(nèi)叢狀層的水腫度均有所減輕。5)細胞歸巢：免疫組織化學(xué)染色及共聚焦結(jié)果示,人源細胞在視網(wǎng)膜上散在分布,可能與視網(wǎng)膜血管有密切關(guān)系。6)移植安全性：HE染色鏡下可見糖尿病腎病改變及腎臟多發(fā)腫瘤。僅聯(lián)合組可以見到大量腎小管細胞管型。胰腺的胰島細胞數(shù)目有所減少。心、肝、脾的結(jié)構(gòu)大致正常。免疫組化結(jié)果示人源細胞密集于大鼠的脾臟和腎臟腫瘤周圍,可見于肝臟匯管區(qū),偶見于腎小管管壁和聯(lián)合組的腎小管管腔。結(jié)論：AMSCs能夠改善DR大鼠的BRB功能,該作用可能是通過抗炎作用來實現(xiàn)。單純低劑量AMSCs治療組能夠更快改善DR大鼠的BRB功能。單純AMSCs注射治療DR的效果優(yōu)于聯(lián)合ELCs組。
【圖文】：

圖１－２－４－１：視網(wǎng)膜流水沖洗過夜圖邐１－２－４－２：消化后鋪展開的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)逡逑（左上小圖中紅色箭頭示大鼠視網(wǎng)膜）逡逑

圖１－３－３－１：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)鋪片肥染色（１００Ｘ）左，，大血管旁毛細血管網(wǎng)（藍色箭頭示閉鎖的逡逑毛細血管，植色箭頭示周細胞）；中，中等血管旁的毛細血管網(wǎng)（藍色箭頭示閉鎖的毛細血管，逡逑紅色箭頭示毛細血管間橋）；右，終末毛細血管網(wǎng)（藍色箭頭示閉鎖的毛細血管，紅色箭頭示逡逑擴張的無細胞毛細血管）。注：由于毛細血管管壁乏光滑感，很難認定影周細胞（文獻中提及逡逑的影周細胞為微突出于毛細血管管壁無細胞核的周細胞），故圖中不再標(biāo)出。逡逑１．邋４討論逡逑１．４．１糖尿病建模方法的選擇逡逑臨床上糖尿病分為：Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病和其它特異性糖尿�。郏玻�。Ｉ型糖逡逑尿病的基本病變?yōu)槟uＰ細胞破壞所致的膜島素絕對性缺乏。ＩＩ型糖尿病的基本病逡逑變?yōu)榘驆u素抵抗合并族島素分泌不足。其它特異性糖尿病包括：Ｐ細胞功能的基因逡逑缺陷、族島素作用的基因缺陷、感染、藥物或化學(xué)制劑所致的糖尿病等。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R774.1

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號：2566200