發(fā)布時間：2019-11-23 00:28

【摘要】：[目的] 1.采用MTT比色法來檢測益氣解毒方不同有效部位對鼻咽癌細胞CNE2的抑瘤作用,初步篩選該方抗鼻咽癌的有效部位。 2.觀察益氣解毒方乙酸乙酯提取物(EAE)對荷鼻咽癌細胞移植瘤裸鼠的抑瘤效率及其對腫瘤微環(huán)境DC功能相關細胞因子分泌活性的影響,進一步確定益氣解毒方乙酸乙酯提取物干預鼻咽癌腫瘤微環(huán)境DC的藥學效應。 3.觀察益氣解毒方有效部位乙酸乙酯提取物對鼻咽癌患者外周血樹突狀細胞分化發(fā)育及T細胞活化的干預效應,確定該提取物對鼻咽癌患者DC相關抗腫瘤免疫病理學學的影響。 [方法] 第一部分益氣解毒方不同極性部位的提取及其抗鼻咽癌活性的研究 采用不同的溶劑將益氣解毒方分離為不同的極性部位,然后應用MTT比色法測定該方各個提取部位的抑瘤效應。 第二部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤微環(huán)境DC相關免疫病理學的干預效應研究 1.鼻咽癌CNE2細胞的常規(guī)培養(yǎng) 2.在BALB/c裸鼠制備CNE2細胞移植瘤模型 3.將荷瘤裸鼠隨機分為四組：模型組、益氣解毒方乙酸乙酯提取物組(EAE組)、順鉑(DDP)組和聯合治療(EAE+DDP)組,干預處理12d后,期間觀察裸鼠的一般行為狀況的變化,然后處死裸鼠,獲取組織標本,檢測相關指標。 4.比較各組荷瘤裸鼠的抑瘤率。 5.用SABC免疫組化法檢測比較各組移植瘤組織中IL-12和MHC-Ⅱ的蛋白表達含量。 6.采用ELISA法檢測比較各組移植瘤組織中IL-4、IL-12和IFN-γ的水平含量。 7.運用RT-PCR法檢測比較各組移植瘤組織中IL-4、IL-12和IFN-γ的基因表達水平。 第三部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對鼻咽癌患者外周血體外誘導之DC相關功能的干預效應研究 1.無菌分離鼻咽癌患者外周血單個核細胞(PBMC),應用重組人粒細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重組人白介素-4(rhIL-4)體外誘導生成DC,同時在培養(yǎng)液中加入不同濃度的益氣解毒方乙酸乙酯提取物(100μg/ml,200μg/ml),并設立生理鹽水(NS)對照組,以觀察DC的形態(tài)特征及功能變化。 2.在DC培養(yǎng)的第7d,收集并調整細胞密度,應用流式細胞儀檢測其表面標志物CDla、CD86和HLA-DR的表達情況。 3.收集每次換下的培養(yǎng)上清液,采用ELISA法檢測其中的細胞因子IL-12水平動態(tài)變化。 4.應用MTT比色法檢測經益氣解毒方EAE刺激后DC誘導的CTL對鼻咽癌細胞CNE2的殺傷效率 [結果] 第一部分益氣解毒方不同極性部位的提取及其抗鼻咽癌活性的研究 益氣解毒方經溶劑提取法制備,獲得了多糖提取部位、乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位。多糖和乙醇提取部位無明顯的抑瘤作用；乙酸乙酯提取物在100μg/ml已具有明顯的抑瘤作用,且抑瘤率與藥物劑量呈明顯的正相關關系。 第二部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤微環(huán)境DC相關免疫病理學的干預效應研究 1.各處理組動物的一般情況比較 模型動物觀察過程中,精神狀態(tài)好,活動自如,攝食和飲水正常、大小二便正常,期間無明顯不良反應。EAE組裸鼠未見明顯的藥物毒副反應,精神狀態(tài)好,對刺激反應明顯,生存質量好；其次為聯合治療組；再次為模型組；DDP組藥物毒副反應明顯,拱肩縮背、行動緩慢、體態(tài)倦怠等表現,生存質量最差。 2.益氣解毒方有效部位EAE、DDP及聯合用藥都可以明顯提高荷瘤裸鼠的抑瘤率,但EAE聯合DDP對移植瘤具有更好的協(xié)同抑瘤作用。 3.免疫組化法檢測結果顯示：與模型對照組比較,EAE組、DDP組和聯合用藥組移植瘤組織中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表達水平升高,差異的統(tǒng)計學意義顯著(P0.01)。與EAE組比較,DDP組中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表達水平降低,而聯合用藥組中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 4.各組裸鼠移植瘤組織中IL-4、IL-12、IFN-γ水平含量比較 經不同藥物對各組移植瘤模型進行處理后,EAE組、DDP組和聯合治療組移植瘤組織勻漿上清液中IL-12、IFN-γ含量水平均增加,而IL-4含量水平降低,與模型組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與EAE組比較,DDP組上清液中IL-12、IFN-γ水平含量水平降低,IL-4含量水平升高,聯合治療組上清液中IL-12、IFN-γ水平含量水平升高,IL-4含量水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。以上結果說明,益氣解毒方乙酸乙酯提取物和DDP均能增加鼻咽癌細胞移植瘤微環(huán)境中IL-12、IFN-γ含量水平,降低IL-4含量水平,但益氣解毒方EAE單用的效果優(yōu)于DDP,而兩者聯合運用則能更有較地調節(jié)鼻咽癌細胞移植瘤微環(huán)境中Th1與Th2相關因子的含量水平變化趨勢,有利于克服腫瘤微環(huán)境中的免疫耐受現象。 5.腫瘤組織IL-4、IL-12、IFN-γ基因表達水平比較 經藥物干預后,與模型對照組比較,EAE組和聯合治療組中IL-12、IFN-γ基因表達水平增加,IL-4基因表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。EAE組與DDP組比較,IL-12、IFN-γ基因表達水平增加,IL-4基因表達水平降低；EAE組與聯合治療組相比,后者IL-12、IFN-γ基因表達水平增加,IL-4基因表達水平降低更加顯著,其差異都具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。以上結果說明益,氣解毒方乙酸乙酯提取物能增加IL-12、IFN-γ基因表達水平,降低IL-4的基因表達水平,其變化趨勢與鼻咽癌細胞移植瘤微環(huán)境中相應細胞因子表達活性相似,能夠有效提高腫瘤微環(huán)境中的細胞免疫效應機制,而且也提示聯合治療組效果更加顯著。 第三部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對體外誘導之鼻咽癌患者外周血DC相關功能的干預效應研究 1.益氣解毒方EAE可以促進體外誘導之鼻咽癌患者外周血DC分化及成熟,培養(yǎng)第1d后即可見大部分細胞貼壁,許多細胞聚集并均勻分散形成細胞集落。第2～3d可見細胞有少量短突起,部分細胞不規(guī)則,部分細胞開始呈現半懸浮和懸浮狀態(tài)。第4d后高劑量組中可見大部分細胞有突起伸出交織在一起,低劑量和NS組有部分細胞伸出突起。第7d低、高劑量中的細胞變大變圓,大部分DC從貼壁變成懸浮狀態(tài),而NS組中的細胞密度較低,且懸浮的細胞也較少。 2.益氣解毒方EAE能增加DC表面CD1a、CD86和HLA-DR的表達,高劑量組作用顯著,與對照組相比統(tǒng)計學意義非常顯著(P0.01)。 3. ELISA法檢測第2d、第4d和第6d的培養(yǎng)上清液,結果發(fā)現IL-12的含量隨著培養(yǎng)天數的增加而升高。低濃度和高濃度益氣解毒方EAE組中IL-12濃度均比NS對照組明顯增高(P0.01)；與低濃度組相比,高濃度EAE組中IL-12濃度也明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義 4.益氣解毒方EAE能促進體外誘導之鼻咽癌患者外周血DC的成熟,提高DC誘導的CTL對CNE2細胞的殺傷活性,具有劑量效應關系,與NS對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 [結論] 1.乙酸乙酯提取部位為益氣解毒方抗鼻咽癌的有效部位； 2.益氣解毒方EAE對鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤具有較強的抑瘤作用,聯合運用順鉑能進一步增強其抑瘤率,有效提高荷瘤裸鼠治療后的生存質量。 3.益氣解毒方EAE聯合順鉑能有效提高免疫活性細胞MHC-Ⅱ、IL-12和IFN-y的含量及其基因表達水平,降低IL-4的含量及基因表達水平,促使腫瘤微環(huán)境中Th1/Th2系統(tǒng)分化活性向Th1方向漂移,從而有利于改善腫瘤微環(huán)境中免疫耐受現象,促進抗腫瘤免疫效應。 4.益氣解毒方EAE能有效刺激體外誘導之鼻咽癌患者外周血DC的分化成熟,增加DC表面的CD1a、CD86和HLA-DR的陽性表達；促進DC的IL-12分泌活性；經益氣解毒方EAE激活的DC,能增強T細胞的增殖反應,強化CTL對鼻咽癌靶細胞的殺傷活性。 5.益氣解毒方EAE可能通過調節(jié)鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中DC的功能功能狀態(tài),提高其腫瘤抗原遞呈能力,從而促進荷瘤機體對腫瘤發(fā)揮細胞免疫應答。
【學位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2564726