【摘要】：頭頸鱗癌是全球第六大高發(fā)癌。由于早期癥狀隱匿，絕大多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期。當(dāng)前，晚期頭頸鱗癌的治療策略依舊是以手術(shù)為主的放化療為輔的綜合治療。然而，當(dāng)前的治療方案不僅剝奪了正常的發(fā)聲及吞咽功能，更重要的是，生存率近幾十年未見(jiàn)明顯的改善。因此，更深入的了解導(dǎo)致治療失敗的原因?qū)τ趯で笥行У目鼓[瘤治療方案是至關(guān)重要的。 由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，過(guò)度的氧消耗及異常的瘤內(nèi)血管結(jié)構(gòu)，實(shí)體腫瘤內(nèi)部存在乏氧的區(qū)域。而且，越來(lái)越的的數(shù)據(jù)表明，瘤內(nèi)低氧與惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，包括頭頸鱗癌。造成這種情況的直接原因是乏氧區(qū)域限制了腫瘤藥物的浸潤(rùn)彌散。除此以外，低氧可以激活許多反應(yīng)因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧適應(yīng)，甚至抵抗治療。在這些因子當(dāng)中，低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor, HIF-1α)起到了至關(guān)重要的作用，因?yàn)槠涫堑脱跸嚓P(guān)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的核心。HIF-1α由氧依賴(lài)表達(dá)的α亞基和一個(gè)持續(xù)表達(dá)的β亞基構(gòu)成。在常氧條件下，α亞基通過(guò)蛋白酶體途徑迅速降解，而在低氧條件下其保持穩(wěn)定。HIF-1α經(jīng)過(guò)磷酸化后形成活性形式。磷酸化的HIF-1α轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與低氧相關(guān)反應(yīng)元件綁定轉(zhuǎn)錄下游一系列因子，包括抗凋亡因子Bcl-2，Survivin及Xiap，誘導(dǎo)血管形成的VEGF，多耐藥基因(MDR)等。 然而，低氧是一個(gè)籠統(tǒng)的概念，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞與血管的距離影響著腫瘤細(xì)胞的表型及遺傳型。對(duì)于位置距離血管較遠(yuǎn)的細(xì)胞，氧氣從血管彌散至腫瘤細(xì)胞具有一定的限制性，這導(dǎo)致相對(duì)穩(wěn)定的，持續(xù)的低氧狀態(tài)，被稱(chēng)為慢性低氧(chronic hypoxia)；然而，近血管的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷著低氧-氧復(fù)合-再低氧的周期性變化，成為周期性低氧(cyclic hypoxia)。對(duì)于前者，目前已經(jīng)研究的非常廣泛，而且是普遍的實(shí)驗(yàn)室低氧條件；至于后者，最近才被發(fā)現(xiàn)，其導(dǎo)致腫瘤惡性度增高的機(jī)制仍然有待于研究。目前，為數(shù)不多的相關(guān)研究證實(shí)周期性低氧在腫瘤治療抵抗及轉(zhuǎn)移的誘導(dǎo)上起著至潛在的作用。周期性低氧可以誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)而對(duì)放療產(chǎn)生抵抗。然而，，據(jù)我們所知，周期性低氧在頭頸鱗癌中還沒(méi)有相關(guān)研究。 腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cells, CSCs）是腫瘤組織中的一種異質(zhì)性群體，像正常的干細(xì)胞一樣，CSCs被認(rèn)為是腫瘤的起源，它們能夠自我更新而不是像其他細(xì)胞一樣分化死亡。這類(lèi)細(xì)胞群體還具有較高的治療抵抗特性。因此，盡管治療后瘤體組織減小或消失，但治療后的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移歸因于殘存的CSCs。當(dāng)前的觀點(diǎn)認(rèn)為，CSCs受其周?chē)牡脱跷h(huán)境所影響。我們?cè)?jīng)推測(cè)CSC可能受周期性低氧所維持。本課題給該假說(shuō)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 目的：（1）研究急性周期性低氧對(duì)喉癌細(xì)胞治療抵抗的作用及機(jī)制。（2）觀察慢性周期性低氧對(duì)喉癌細(xì)胞化療抵抗的誘導(dǎo)作用及可能的機(jī)制。 方法：（1）通過(guò)MTT方法檢測(cè)各種低氧條件下喉癌細(xì)胞對(duì)藥物順鉑的敏感性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期性低氧條件下喉癌細(xì)胞的周期分布情況；Western Blot檢測(cè)P27，CyclinD1及CDK4蛋白的表達(dá)；Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)STAT3，p-STAT3及HIF-1α在各組的表達(dá)情況；通過(guò)建立HIF-1α穩(wěn)定敲除細(xì)胞系，進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α在周期性低氧誘導(dǎo)的喉癌細(xì)胞化療抵抗中的作用以及對(duì)STAT3激活的調(diào)節(jié)作用。（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)以上兩種周期性低氧對(duì)喉癌細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的富集作用。（3）Hep-2細(xì)胞反復(fù)暴露于低氧/氧復(fù)合30次，建立慢性周期性低氧作用Hep-2細(xì)胞(CIH Hep-2細(xì)胞)，通過(guò)MTT法觀察Hep-2細(xì)胞和CIH Hep-2細(xì)胞的增殖情況；通過(guò)MTT法觀察Hep-2細(xì)胞和CIH Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；Western blot初步觀察細(xì)胞內(nèi)與增殖及預(yù)后不良的因子的表達(dá)情況。 結(jié)果：（1）MTT實(shí)驗(yàn)表明急性周期性低氧可以顯著誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑長(zhǎng)時(shí)程及短時(shí)程處理的抵抗作用，但這種抵抗在細(xì)胞恢復(fù)正常條件培養(yǎng)一段時(shí)間后被逆轉(zhuǎn)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示急性周期性低氧誘導(dǎo)的化療抵抗與周期分布無(wú)關(guān)；Western blot證實(shí)HIF-1α隨著低氧/氧復(fù)合周期的增多呈現(xiàn)出遞增性的表達(dá)上調(diào)而且隨周期次數(shù)的遞增，HIF-1α于氧復(fù)合期保持穩(wěn)定；沉默HIF-1α可以逆轉(zhuǎn)周期性低氧誘導(dǎo)的化療抵抗作用；周期性低氧誘導(dǎo)的HIF-1α是由組成性激活的STAT3調(diào)節(jié)；急性周期性低氧可以顯著上調(diào)CD133+細(xì)胞群比率（2）建立的CIH Hep-2細(xì)胞表現(xiàn)出了較高的增殖能力及對(duì)順鉑的耐藥性，Western blot實(shí)驗(yàn)表明兩種細(xì)胞中VEGF及p-STAT3表達(dá)上調(diào) 結(jié)論： （1）急性周期性低氧可以顯著的誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的抵抗作用，這種效應(yīng)的機(jī)制主要是由于(低氧/氧復(fù)合)周期依賴(lài)的HIF-1α表達(dá)遞增(cycle dependentevlevated expression of HIF-1α)效應(yīng)而不是細(xì)胞周期變化的結(jié)果。 （2）周期低氧條件下HIF-1α的表達(dá)是由組成性激活的STAT3調(diào)控。 （3）急性周期性低氧所誘導(dǎo)的化療抵抗不是“選擇壓力”的結(jié)果。 （4）急性周期性低氧可以富集喉癌CD133+細(xì)胞比率 （5）慢性長(zhǎng)期的周期性低氧誘導(dǎo)的喉癌細(xì)胞化療抵抗作用可能是由于內(nèi)在多因子表達(dá)變化的結(jié)果。 我們的研究結(jié)果所帶來(lái)的臨床啟示：聯(lián)合靶向STAT3和HIF-1α可以起到短期的逆轉(zhuǎn)急性周期性低氧誘導(dǎo)的喉癌細(xì)胞抵抗作用，而長(zhǎng)期的系統(tǒng)治療則需靶向周期性低氧所誘導(dǎo)的細(xì)胞基因?qū)W不穩(wěn)定性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R739.65

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8 周q

本文編號(hào)：2553857