【摘要】：背景和目的 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)在我國南部,尤其在廣東省高發(fā),其發(fā)病率可達25/10萬。2008年全世界新增鼻咽癌病例84400人,死于鼻咽癌患者51600人,其中大部分在我國南方。鼻咽癌的治療方案是以放射治療為主的綜合治療,早期病例治療效果較好。遠處轉移鼻咽癌預后不良,中位生存時間僅12～20個月,化療是轉移性鼻咽癌的主要治療方法,但治療效果差,反應率僅有50～80%,僅能延長鼻咽癌患者中位生存期5-11個月。鼻咽癌總的遠處轉移率可達25～30%,5年內死亡的首診未轉移病例有2/3歸因于遠處轉移。因此,明確鼻咽癌的轉移機制并由此探索新的治療方法對延長鼻咽癌患者的生存時間具有重要意義。 血管生成是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管,是惡性腫瘤的主要特征之一。與正常人體組織一樣,惡性腫瘤也需要氧氣和營養(yǎng)成分進行新陳代謝,同時還需排出二氧化碳和有害代謝產物,所以血管生成對于腫瘤至關重要。腫瘤發(fā)展至1～2mm3,就需要新生血管的滋養(yǎng)才能維持生長,否則就處于靜止狀態(tài)。新生血管基底膜的通透性較高,腫瘤細胞可直接穿透血管進入血流發(fā)生轉移。因此,血管生成是腫瘤生長和轉移的基礎,抑制血管生成即可有效控制腫瘤,增強化療藥物的療效,延長患者的生存時間,是腫瘤分子靶向治療的重要方法。目前,已運用于臨床的抗血管生成分子靶向藥物如貝伐單抗(bevacizumab)和索拉非尼(sorafenib)等在卵巢癌、乳腺癌、腎癌和肝癌等惡性腫瘤的晚期治療中已取得較好的效果,有效延長了患者的生存時間。研究者使用貝伐單抗對1528例卵巢癌患者進行Ⅲ期臨床試驗,結果顯示治療進行至第42月時,貝伐單抗可延長無進展生存期近4個月。 Zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste ho mo log2, EZH2)是poly comb group (PcG)基因家族的重要成員,與EED (embryonic ectoderm development)、 SUZ12(suppressor of zeste12)和RbAp46/48共同組成PRC2,將靶基因組蛋白H3K27甲基化,導致靶基因沉默,是分子靶向治療的潛在靶標。研究顯示,與局限性前列腺癌和良性前列腺腫瘤相比,EZH2在轉移性前列腺癌中表達升高并可促進前列腺癌的生長和轉移；EZH2還與前列腺癌的預后有關,是前列腺癌的癌基因。EZH2在乳腺癌中同樣表達上調并可增強乳腺癌細胞的侵襲能力；EZH2還可通過抑制乳腺癌細胞雌激素受體a (estrogen receptor a, ERa)表達降低乳腺癌的治療敏感性。同時,EZH2在白血病、卵巢癌、肝癌等惡性腫瘤中也存在表達上調情況,并與這些腫瘤的發(fā)生、生長、轉移和預后密切相關。最近研究還發(fā)現(xiàn)EZH2可能通過促進血管生成影響腫瘤的生長和轉移。 EZH2對腫瘤血管生成的作用已見諸多報道。研究者發(fā)現(xiàn)EZH2在卵巢癌內皮細胞中表達升高,并可通過抑制血管抑制蛋白1(vasohibin1, VASH1)表達促進卵巢癌血管生成。而在EZH2的上游,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)通過轉錄因子E2F上調了EZH2的表達。EZH2在惡性膠質瘤內皮細胞中的表達也明顯上調,EZH2基因沉默可抑制人腦微血管內皮細胞(human brain micro vascular endothelial cells, HBMVECs)遷移和成管能力,惡性膠質瘤中VEGF通過miR-101靶向調控EZH2而形成VEGF/miR-101/EZH2軸,促進血管生成。另外,近期的一項研究顯示成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor2, FGF-2)同樣通過miR-101調控EZH2,促進腫瘤的血管生成。 本課題組前期通過RT-qPCR方法檢測了18例鼻咽癌和16例鼻咽炎標本,發(fā)現(xiàn)鼻咽癌標本中EZH2mRNA表達升高,為鼻咽炎的2.12倍。而且,EZH2可調控鼻咽癌細胞的細胞周期并促進其增殖。隨后,本課題組進一步發(fā)現(xiàn)EZH2表達與鼻咽癌的臨床分期、轉移和預后關系密切,是鼻咽癌的獨立預后指標。我們課題組的研究結果也得到其它文獻證實,Hwang等通過RT-PCR和Western blot方法發(fā)現(xiàn)EZH2在鼻咽癌中表達升高,并與腫瘤的臨床分期和患者生存期縮短有關；Tong等發(fā)現(xiàn)EZH2在鼻咽癌細胞中通過靶向抑制E-cadherin表達促進鼻咽癌轉移。上述研究表明EZH2可促進鼻咽癌細胞增殖和侵襲,并與腫瘤的分期、轉移、復發(fā)、生存期縮短和預后不良密切相關,是鼻咽癌治療的潛在靶標,但是EZH2對鼻咽癌生長和轉移的促進作用是否通過影響腫瘤血管生成實現(xiàn)尚未見報道。 因此,本研究通過免疫組化(immunohistochemistry, IHC)方法檢測鼻咽癌患者組織標本EZH2和CD34表達,分析EZH2與腫瘤內微血管密度(intratumor microvessel density, MVD)的相關性,初步探索EZH2與鼻咽癌血管生成的關系；隨后通過改變EZH2的表達水平,在體外細胞增殖、侵襲和成管實驗,以及體內雞胚絨毛尿囊膜(chicken embryo chorioallantoic membrane, CAM)血管生成模型和裸鼠肝包膜下移植瘤模型實驗中,闡明EZH2對鼻咽癌血管形成的影響；最后通過RT-qPCR和ELISA檢測血管生成相關因子,初步探討EZH2影響鼻咽癌血管生成的下游基因,為進一步揭示EZH2影響鼻咽癌生長和轉移機制奠定基礎,同時對鼻咽癌分子靶向治療的靶點研究也有積極的參考意義。 方法 1、細胞株和實驗動物 293T細胞、人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)細胞購自廣州弗爾博公司,5-8F、6-10B為南方醫(yī)院耳鼻喉科實驗室凍存。293T細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,5-8F、6-10B、HUVECs細胞用10%FBS的1640培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)傳代。雞胚,中國黃雞,6日齡種蛋,購自廣東粵禽育種有限公司。實驗用裸鼠,BALB/c-nu/nu雌性裸鼠,購自中山大學實驗動物中心,SPF條件下分籠飼養(yǎng)。 2、組織標本 69例初診未治療非角化未分化型鼻咽癌標本均取自2004年9月～2008年12月就診于南方醫(yī)院并行鼻咽部活檢患者,標本的獲取經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。 3、免疫組化 免疫組化按3步法常規(guī)進行染色,EZH2染色結果判定以胞核染成棕黃色為陽性細胞,染色結果以半定量的染色指數(shù)(staining index, SI)評估,染色指數(shù)(SI)為染色范圍和染色強度乘積,染色強度(staining intensity)分為：0分：陰性；1分：弱陽性；2分：陽性；3分：強陽性。腫瘤細胞染色范圍(positive tumor cell area)以染色癌細胞占癌細胞總數(shù)百分比計算：0分：癌細胞未見染色；0分：≤10%；1分：11～25%；2分：26～50%；3分：51～75%；4分：76%。MVD計數(shù)參照文獻報道進行,CD34染色后,先用低倍鏡(×40～100)掃視玻片,尋找血管密度最高的區(qū)域,即“熱點”("hotspots"),后在高倍鏡下(×400)計數(shù)視野內被染色的血管數(shù),即為MVD。 4、病毒包裝、轉染 空載質粒pLVTHM以及穩(wěn)定過表達和沉默EZH2基因的兩個慢病毒表達載體為南方醫(yī)院耳鼻喉科實驗室保存。采用293T細胞常規(guī)病毒包裝,轉染鼻咽癌細胞,流式細胞分選(fluorescence activated cell sorter, FACS)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)陽性細胞,構建穩(wěn)定轉染細胞株 5、RT-qPCR 分別采用Trizol、TaKaRa RT試劑盒和復能公司All-in-OneTM qPCR Mix試劑盒進行總RNA提取、逆轉錄和熒光定量PCR反應,反應體系和實驗操作按照說明書進行。以2-△△α表示表示各基因的相對表達。 6、Western blot RIPA buffer裂解細胞,Pierce公司BCA Protein Assay Reagent Kit進行蛋白定量,計算出待測樣品的蛋白濃度。常規(guī)SDS-PAGE電泳,PVDF膜濕轉法轉膜,一抗4℃孵育過夜。二抗(1：3000)室溫雜交。化學發(fā)光暗室X膠片顯影、定影及掃描。 7、MTT assay 胰酶消化HUVECs細胞,每孔接種細胞2×103個,設對照孔及調零孔,24小時后吸凈培基,穩(wěn)定轉染細胞上清與全培1：1混合液繼續(xù)培養(yǎng)1-4天,于培養(yǎng)0-4天(0、24、48、72小時)后加入20μL MTT(5ug/mL)和DMSO,酶標儀檢測各孔OD值。 8、Transwell invasion assay 在Boyden小室上室加入200μL稀釋的Matrigel膠,過夜干燥,HUVECs細胞分別用不同細胞上清混合液連續(xù)培養(yǎng)4天,1×105/孔接種細胞,下室用分別加入細胞上清混合液,繼續(xù)培養(yǎng)16小時。0.1%結晶紫溶液染色,拍照,計數(shù)細胞。 9、Tube formation assay 在96孔板中各加入501μL預解凍Matrigel膠,HUVECs細胞分別用不同細胞上清混合液連續(xù)培養(yǎng)4天,2×104/孔接種細胞,細胞上清混合液繼續(xù)培養(yǎng)18小時,拍照,采用Image Pro Plus6.0軟件,計數(shù)比較管狀結構相對長度。 10、CAM血管生成模型 雞胚用70%乙醇擦拭干凈,置入超凈臺,小心去除雞胚氣室端外殼、外膜和內膜,開窗大小約2×2cm,暴露絨毛尿囊膜,放置硅膠圈1枚,2×106/雞胚種植細胞,第2日小心取出硅膠圈,繼續(xù)孵育5日。取出雞胚,拍照,滴加10%福爾馬林殺死雞胚并固定尿囊膜,30mmin后剪下尿囊膜,倒置顯微鏡下(×40)計數(shù)移植瘤新生血管數(shù)(vessels number, VN) 11、裸鼠肝包膜下鼻咽癌移植瘤模型 以1%戊巴比妥鈉按照40mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠,肝包膜下1.0×106/只接種細胞,24天后取出荷瘤裸鼠肝臟及肺臟組織,PBS沖洗2次,分離肝臟移植瘤,拍照,稱重；固定,常規(guī)石蠟包埋,CD34免疫組化染色。 12. ELISA 細胞上清VEGF蛋白濃度采用RD公司Human VEGF Valukine ELISA Kit試劑盒檢測,按照說明書操作。 13、統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料均采用x±s表示。計量資料兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗(independent-samples t test),等級資料兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗,MTT增殖曲線采用析因方差分析(factorial design ANOVA)比較,單獨效應分析采用One-way ANOVA比較；相關分析采用Spearman法。檢驗水準α=0.05。 結果 1、鼻咽癌EZH2表達與MVD相關性分析 采用免疫組化方法,檢測69例非角化未分化型鼻咽癌組織中EZH2及CD34的表達,計算MVD。結果顯示：EZH2高表達組(SI3,32例)MVD為(36.7+13.8),低表達組(SI3,37例)為(24.0+9.0),高表達組MVD顯著高于低表達組(t檢驗,t=-4.46I,P0.001)；Spearman秩相關分析顯示,EZH2染色指數(shù)(SI)與MVD存在中度正相關關系(r=0.480,P0.001)。 2、EZH2影響鼻咽癌體外血管生成 采用慢病毒穩(wěn)定轉染方式,分別沉默5-8F細胞EZH2基因,過表達6-10B細胞EZH2基因,構建5-8F Lv-vector、5-8F Lv-shEZH2;6-1OB Lv-vector、6-10B Lv-EZH2兩組共4個穩(wěn)定轉染細胞株。RT-qPCR方法檢測EZH2表達改變,結果顯示：5-8F Lv-shEZH2細胞的EZH2表達相對于5-8F Lv-vector細胞下調73.1%(t檢驗,t=14.922,P0.001),6-10F Lv-EZH2細胞EZH2表達相對于6-10B Lv-vector細胞則上調了5.6倍(t檢驗,r=-23.927, P=0.002)。Western blot檢測驗證了EZH2的沉默和過表達效果,表明穩(wěn)定轉染細胞株構建成功,結果可靠,可進行后續(xù)實驗。 分別取EZH2基因沉默/過表達細胞上清培養(yǎng)誘導HUVECs,通過MTT方法檢測鼻咽癌細胞EZH2表達對HUVECs細胞增殖能力的影響。研究結果顯示：相對于5-8F Lv-vector,5-8F Lv-shEZH2細胞上清誘導的HUVECs細胞生長速度下降(析因方差分析,F=495.314,P=0.000)；相對于6-1OB Lv-vector,6-10B Lv-EZH2細胞上清誘導的HUVECs細胞OD值顯著升高,生長速度加快(析因方差分析,F=532.764,P=0.000),表明鼻咽癌細胞EZH2基因過表達促進HUVECs增殖,沉默則抑制HUVECs增殖。 采用Tran swell invasion方法檢測鼻咽癌EZH2表達對HUVECs侵襲能力影響,結果顯示：EZH2基因沉默5-8F Lv-shEZH2細胞上清誘導的HUVECs穿膜細胞數(shù)為(93.8+23.0),5-8F Lv-vector細胞上清組則為(149.9+21.3),EZH2沉默使HUVECs穿膜細胞數(shù)減少37.4%(t檢驗,t=9.811,P0.001),表明HUVECs細胞侵襲力下降；EZH2基因過表達6-10B Lv-EZH2細胞上清誘導的HUVECs穿膜細胞數(shù)為(174.9+27.5),空載對照6-10B Lv-vector細胞上清組為(118.8±17.7),EZH2基因過表達使HUVECs穿膜細胞數(shù)增加47.2%(t檢驗,t=9.811,P0.001),表明HUVECs細胞侵襲力增強。 采用Tube formation方法檢測鼻咽癌EZH2表達對HUVECs分化成管能力影響,結果顯示：相對于5-8F Lv-vector,5-8F Lv-shEZH2細胞上清誘導的HUVECs相對小管長度由(110.1土21.4)縮短到(19.9+7.8),縮短81.9%(t檢驗,t=15.338,P0.001),表明HUVECs分化成管能力減弱；相對于6-10BLv-vector,6-10B Lv-EZH2細胞上清誘導的HUVECs相對小管長度由(100.9±23.4)增加到(152.7±±31.2),增加51.3%(t檢驗,t=-5.143,P0.001),表明HUVECs侵襲能力增強,該結果表明鼻咽癌細胞EZH2基因過表達促進HUVECs分化成管,沉默則抑制HUVECs分化成管。 3、EZH2影響鼻咽癌體內血管生成 將穩(wěn)轉細胞株接種在CAM血管生成模型上和裸鼠肝包膜下,分別建立鼻咽癌CAM血管生成模型及裸鼠肝包膜下移植瘤模型,檢測EZH2表達對鼻咽癌細胞體內腫瘤血管生成能力的影響。CAM血管生成模型研究結果顯示：種植腫瘤細胞6日后均可見移植瘤形成,EZH2基因沉默的5-8F Lv-shEZH2細胞移植瘤新生血管數(shù)(26.0±±7.1)較空載對照(38.1±±8.2)減少37.8%(t檢驗,t=3.524,P=0.002)：EZH2基因過表達的6-10B Lv-EZH2細胞移植瘤新生血管數(shù)(41.3±6.4),較對照細胞(34.2±6.7)增加26.6%(t檢驗,t=-2.425,P=0.026)。裸鼠肝包膜下鼻咽癌移植瘤模型研究結果顯示：接種后第24天實驗結束時,EZH2基因沉默的5-8F細胞肝臟移植瘤體積明顯縮小,重量下降86.4%(t檢驗,t=3.266,P=0.027)。免疫組化染色方法檢測移植瘤MVD,研究結果顯示,EZH2基因沉默的5-8F Lv-shEZH2細胞MVD(13.0+4.3)較空載對照(29.6±12.1)下降56.1%(t檢驗,t=2.896,P=0.020)。 4、EZH2影響鼻咽癌血管生成作用機制的初步研究 通過RT-qPCR方法檢測穩(wěn)定轉染鼻咽癌細胞株,初步篩選血管生成相關基因,研究結果顯示：EZH2基因沉默的5-8F Lv-shEZH2細胞VEGF表達下調65.4%(t檢驗,t=27.175,P=0.000),而EZH2基因過表達的6-10B Lv-EZH2細胞VEGF表達升高4.87倍(t檢驗,t=8.680,P=0.001)。ELISA方法檢測穩(wěn)定轉染鼻咽癌細胞上清,研究結果顯示：EZH2基因沉默的5-8F Lv-shEZH2細胞上清VEGF濃度顯著下降(t檢驗,t=13.431,P=0.000)；EZH2基因過表達的6-10B Lv-EZH2細胞上清VEGF濃度顯著升高(t=-10.427,P=0.000),提示鼻咽癌中VEGF可能是EZH2的下游基因,EZH2促進鼻咽癌血管生成可能通過VEGF實現(xiàn)。 結論 1、EZH2與鼻咽癌MVD呈正相關。 2、體外過表達鼻咽癌細胞的EZH2可促進內皮細胞HUVECs的增殖、侵襲和分化成管；EZH2基因沉默可抑制HUVECs的增殖、侵襲和分化成管。 3、在體內,CAM血管生成模型與裸鼠肝包膜下移植瘤模型研究均表明EZH2促進鼻咽癌血管生成。 4、VEGF可能是EZH2的下游基因,EZH2可能通過上調VEGF表達促進鼻咽癌的血管生成。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

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本文編號：2543537