【摘要】：年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related Macular Degeneration,AMD)是導(dǎo)致發(fā)達國家以及我國發(fā)達地區(qū)50歲以上老年人群視力喪失甚至失明的一種退行性疾病。疾病過程中涉及的主要結(jié)構(gòu)有感光細胞,視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium,RPE),Bruch 膜和脈絡(luò)膜毛細血管(Choroidal Neovascularization,CNV)等。早期AMD主要表現(xiàn)為玻璃膜疣(drusen)和RPE色素異常,晚期AMD表現(xiàn)為RPE和光感受器地圖狀萎縮(Geographic Atrophy,GA)以及CNV形成。AMD的病因非常復(fù)雜,現(xiàn)認為該病是由多種因素引起的綜合病征,可能與年齡、遺傳、種族、慢性光損傷、營養(yǎng)缺乏、吸煙等因素有關(guān),但其確切的病因尚不清楚。AMD損傷人視覺最重要、最敏銳的黃斑部,造成不可逆的視力喪失,導(dǎo)致許多老年人在退休年齡時失去獨立性,不僅影響患者的生活質(zhì)量,更給國家?guī)硪幌盗械纳鐣徒?jīng)濟問題。近年來,抗氧化劑和礦物質(zhì)補充劑等藥物被用于預(yù)防AMD的發(fā)生或減緩干性AMD的進展,但是療效并不十分理想;而對于濕性AMD,抗血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelium Growth Factor,VEGF)藥物治療可有效挽救部分患者的視力,然而反復(fù)注射會增加患者的經(jīng)濟負擔及治療風險,而且對部分患者的治療效果不佳。因此,尋找新的更安全有效的治療方法和治療靶點成為近年來眼科研究的重點課題之一。近幾年大量研究表明,組織因子(tissue factor,TF)可能參與AMD的發(fā)病機制,研究者認為氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)可引起TF表達上調(diào),從而誘發(fā)AMD的發(fā)生。此外,有實驗數(shù)據(jù)顯示TF不僅參與腫瘤血管的形成,而且參與CNV的形成。組織因子靶向肽(Tissue Factor Targeting Peptide,TF-TP)是課題組成員饒教授合成的一種新型TF靶向性小分子多肽,本研究擬探討TF-TP對AMD可能的應(yīng)用價值。圍繞這一目的,我們開展了兩方面的研究工作:第一部分探討TF-TP對藍光誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Human Retinal Pigment Epithelium,hRPE)損傷的作用及相關(guān)機制;第二部分觀察TF-TP對激光誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脈絡(luò)膜新生血管的作用。目的:1.探討TF-TP對藍光誘導(dǎo)hRPE細胞損傷的作用及相關(guān)機制。2.觀察TF-TP對激光誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脈絡(luò)膜新生血管的作用。方法:1.首先用不同濃度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP 培養(yǎng)正常 hRPE細胞24h后,采用CCK-8法檢測不同濃度TF-TP對正常hRPE細胞有無毒副作用。2.體外培養(yǎng)hRPE細胞分為3組,空白對照組細胞在常規(guī)條件下進行處理;藍光照射組細胞用輻射強度為(4.0±0.5)mW/cm2的藍光照射12h建立藍光損傷細胞模型;TF-TP組細胞先分別用不同濃度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培養(yǎng)細胞24 h,再用藍光照射12h。運用CCK-8法檢測TF-TP作用于藍光損傷hRPE細胞的最佳濃度。并將此最佳濃度用于后面實驗的分組:空白對照組、藍光照射組和最佳濃度TF-TP組。3.分別在普通倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察各組hRPE細胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化;采用Hoechst染色法檢測各組細胞的凋亡情況;并用Western blot法檢測各組細胞中TF蛋白和相關(guān)凋亡蛋白bax和bc1-2的表達。4.采用Western blot法檢測不同藍光照射時間(0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)后hRPE細胞中TF蛋白的表達變化;5.利用532nm激光建立小鼠CNV模型,實驗分組如下:正常對照組小鼠不做任何處理,激光組為單純激光誘導(dǎo)小鼠CNV形成,給藥組為激光后第一天即給予玻璃體腔注射TF-TP,隔天注射一次,共三次。并運用眼底熒光血管造影(FFA)檢查評價各組小鼠CNV滲漏情況。6.采用組織病理學方法觀察激光后14天各組小鼠CNV中央最大厚度;采用免疫組化染色法測定視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜組織中CD34的表達量;7.運用Western Blot法檢測小鼠RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合物中TF蛋白的表達情況。8.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。本研究各檢測指標的數(shù)據(jù)資料經(jīng)W檢驗呈正態(tài)分布,以x±s表示。各檢測指標的均數(shù)經(jīng)Levene檢驗方差齊。兩組測量指標間的差異比較采用獨立樣本t檢驗,多組測量指標間的總體差異比較均采用單因素方差分析(ANOVA),各組間多重比較均采用LSD-t檢驗。P㩳0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.不同濃度TF-TP干預(yù)正常hRPE細胞24h后,各組間細胞存活率無明顯改變(F=2.15,P=0.11),提示TF-TP對hRPE細胞無毒副作用。2.空白對照組、藍光照射組和各濃度TF-TP組細胞存活率分別為(100.0±0.00)%、(43.79±6.55)%、(57.24±7.89)%、(59.97±4.73)%、(63.45±3.57)%、(58.88±5.59)%和(55.95±2.80)%。各組細胞存活率的總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=9.16,P=0.00),與藍光照射組相比,各濃度TF-TP組細胞存活率均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.01、0.00、0.00、0.00、0.00)。150μmol/L TF-TP 組細胞的存活率最高,可作為構(gòu)建TF-TP保護模型,進行后續(xù)實驗。3.光學顯微鏡下和透射電子顯微鏡下顯示,藍光照射組有較多皺縮、變形、懸浮細胞,可見細胞微絨毛數(shù)量減少,部分線粒體嵴斷裂和缺失以及細胞空泡樣變性,而TF-TP組細胞異常形態(tài)的細胞較少,細胞絨毛結(jié)構(gòu)較完整,細胞質(zhì)中空泡樣結(jié)構(gòu)改變和線粒體損傷改變明顯減輕�？瞻讓φ战M、藍光照射組和150μmol/L TF-TP組細胞凋亡率分別為(0.98±0.19)%、(9.98±0.82)%和(5.73±0.88)%,組間總體比較差異有統(tǒng)計學差異(F206.18,P=0.00),其中TF-TP組細胞凋亡率明顯低于藍光照射組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與空白對照組相比,藍光照射組細胞中bax蛋白和TF蛋白的表達量明顯增加,bcl-2蛋白的表達量顯著下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05);與藍光損傷組相比,TF-TP組細胞中bax蛋白和TF蛋白的表達量均明顯下降,而bcl-2蛋白的表達量明顯增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P㩳0.05)。4.不同藍光照射時間(0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)后hRPE細胞中TF蛋白的相對表達量分別為(0.25±0.01)、(0.26±0.02)、(0.28±0.02)、(0.31±0.02)、(0.60±0.03)、(0.79±0.04)和(0.56±0.03)。各組間 TF 蛋白的相對表達量總體間有統(tǒng)計學差異(F=276.99,P㩳0.05),且TF蛋白在hRPE細胞中的表達隨著藍光照射時間的延長逐漸增加,在藍光照射12h時達到高峰,隨后出現(xiàn)下降。5.正常對照組小鼠的FFA檢查顯示:小鼠視網(wǎng)膜血管充盈并以視盤為中心呈放射狀分布,脈絡(luò)膜血管表現(xiàn)為彌漫性背景熒光,無熒光素滲漏。激光組小鼠在光凝后14天,FFA檢查示:視網(wǎng)膜光斑處可見明顯熒光滲漏點,造影晚期呈彌漫性熒光擴散。TF-TP給藥組小鼠的FFA檢查顯示:視網(wǎng)膜光斑處可見輕度熒光滲漏,造影晚期可見滲漏和高熒光點但無明顯擴散。激光組和TF-TP給藥組兩組間滲漏率差異無統(tǒng)計學差異(X2=0.59,P=0.24)。6.與激光組的CNV厚度(115.89±5.04um,n=6)相比,TF-TP給藥組的CNV厚度(60.02±2.48um,n=6)明顯減小,兩者間具有統(tǒng)計學差異(t=24.39,P0.05),提示TF-TP干預(yù)后可以顯著抑制CNV的厚度。免疫組化結(jié)果顯示:TF-TP給藥組的CD34免疫組化陽性反應(yīng)物平均光密度值(0.09±0.03)與單純激光組(0.16±0.01)相比明顯減小,兩者間差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.93,P0.05)。7.Western Blot結(jié)果顯示:正常對照組、激光組、TF-TP給藥組的TF蛋白的相對表達量分別為(0.14±0.01)、(0.40±0.02)、(0.22±0.03),經(jīng)過單因素方差分析可得,各組間TF蛋白的相對表達量總體間有統(tǒng)計學差異(F=128.26,P0.05),各組間進一步多重比較,TF-TP給藥組的TF蛋白相對表達量與激光組比較明顯降低,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)。結(jié)論:1.TF-TP能夠改善藍光誘導(dǎo)損傷的hRPE細胞結(jié)構(gòu),降低細胞凋亡率,減少細胞中TF蛋白和bax蛋白的表達,增加bcl-2蛋白的表達,減輕藍光誘導(dǎo)的hRPE細胞損傷。2.TF-TP可以減小激光誘導(dǎo)的小鼠CNV厚度,降低CD34的陽性表達,減少小鼠RPE脈絡(luò)膜混合物中TF蛋白的表達,抑制小鼠CNV的形成。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R774.5

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