【摘要】：目的探討高壓力培養(yǎng)下角膜內皮細胞凋亡的啟動機制。方法原代兔角膜內皮細胞經免疫組織化學鑒定后,在50mm Hg(1 k Pa=7.5 mm Hg)壓力條件下,培養(yǎng)1 h、2 h、24 h,另設正常壓力(15 mm Hg)作為正常壓力組,培養(yǎng)24 h。第一代兔角膜內皮細胞融合達70%~80%后,細胞在加壓前1 h分別使用濃度均為10~(-6)mol·L~(-1)抗Caspase-8和抗Caspase-9預處理,然后置于壓力裝置中,壓力設定為50 mm Hg,培養(yǎng)24 h后檢測蛋白Bcl-2和P53表達,并且以無抑制劑處理的50 mm Hg壓力培養(yǎng)的細胞為對照組。各組培養(yǎng)的細胞均經Western blot檢測Bcl-2和P53的表達。免疫熒光染色檢測兔角膜內皮細胞胞漿細胞色素C的含量。結果 50 mm Hg壓力組角膜內皮細胞,加壓1 h、2 h、24 h P53的表達量分別為0.651±0.007、0.805±0.006、0.839±0.011,較正常壓力組(0.033±0.004)升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P0.01);50 mm Hg壓力組隨著加壓時間的延長,角膜內皮細胞中P53蛋白表達量逐漸增加,各時間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P0.01)。50 mm Hg壓力組中加壓1 h、2 h、24 h Bcl-2的表達量分別為0.590±0.009、0.724±0.005、0.314±0.016,較正常壓力組(0.081±0.013)反應性升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P0.01);50 mm Hg壓力組各時間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P0.01)。實驗發(fā)現正常壓力組培養(yǎng)24 h后,細胞核呈藍色,胞漿中無細胞色素C釋放;50 mm Hg壓力組培養(yǎng)1 h可見部分細胞胞漿呈紅色,提示細胞色素C釋放進入到胞漿內,隨著加壓時間延長熒光強度增加,加壓24 h見胞漿內出現廣泛紅色強熒光�？笴aspase-9和抗Caspase-8預處理組的角膜內皮細胞P53表達量分別為0.535±0.007、0.703±0.010,較對照組(0.727±0.021)下調,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P0.01);抗Caspase-9和抗Caspase-8預處理組中Bcl-2的表達量呈抑制性下降,分別為0.312±0.003、0.442±0.011,較對照組(0.501±0.011)下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P0.01)�？笴aspase-9預處理組的角膜內皮細胞P53和Bcl-2表達量較抗Caspase-8預處理組下降,差異亦均有統(tǒng)計學意義(均為P0.01),表明抗Caspase-9對高壓下角膜內皮細胞凋亡的抑制作用更顯著。結論Caspase-9抑制劑可有效阻斷高壓力對角膜內皮細胞的促凋亡作用,高壓力對角膜內皮細胞的損傷主要是觸發(fā)了線粒體細胞色素C的釋放,激活了Caspase-9參與的內源性酶聯反應性凋亡途徑。
[Abstract]:Objective to investigate the mechanism of corneal endothelial cell apoptosis in high pressure culture. Methods the primary rabbit corneal endothelial cells were identified by immunohistochemistry and cultured under 50mm Hg (1 k Pa=7.5 mm Hg) pressure) for 1 h, 2 h, 24 h. The normal pressure (15 mm Hg) was used as the normal pressure group and cultured for 24 h. After the fusion of the first generation rabbit corneal endothelial cells reached 70% / 80%, the cells were pretreated with 10 ~ (- 6) mol 路L ~ (- 1) anti-Caspase-8 and anti-Caspase-9 at the concentration of 10 ~ (- 6) mol 路L ~ (- 1) and then placed in a pressure device. The pressure was set at 50 mm Hg, for 24 h to detect the expression of protein Bcl-2 and p53, and the control group was treated with 50 mm Hg pressured cells without inhibitor. The expression of Bcl-2 and p53 were detected by Western blot. The content of cytoplasmic cytochrome C (cytochrome C) in rabbit corneal endothelial cells was detected by immunofluorescence staining. Results the expression of p53 in 50 mm Hg pressure group was 0.651 鹵0.007, 0.805 鹵0.006,0.839 鹵0.011, respectively, which was higher than that in normal pressure group (0.033 鹵0.004). The difference was statistically significant (all P0.01). The expression of p53 protein in corneal endothelial cells increased gradually with the prolongation of the pressure time in 50 mm Hg pressure group (all P0.01). In 50 mm Hg pressure group, the expression of p53 protein increased at 1 h, 2 h, and in the 50 mm Hg pressure group, the expression of p53 protein increased gradually with the prolongation of the pressure time (all P0.01). The expression of Bcl-2 in 24 h group was 0.590 鹵0.009,0.724 鹵0.005,0.314 鹵0.016, which was significantly higher than that in normal pressure group (0.081 鹵0.013) (P0.01). There was significant difference in each time of 50 mm Hg pressure group (P 0.01). It was found that after 24 hours of culture in the normal pressure group, the nucleus was blue and no cytochrome C release was found in the cytoplasm. In the 50 mm Hg pressure group, the cytoplasm of some cells was red at 1 h, suggesting that cytochrome C release into the cytoplasm, the fluorescence intensity increased with the prolongation of the pressure time, and a wide range of red strong fluorescence appeared in the cytoplasm at 24 h under pressure. The expression of p53 in corneal endothelial cells of anti-Caspase-9 and anti-Caspase-8 pretreatment groups was 0.535 鹵0.007 and 0.703 鹵0.010, respectively, which was significantly lower than that of control group (0.727 鹵0.021) (P 0.01). The expression of Bcl-2 decreased in anti-Caspase-9 and anti-Caspase-8 pretreatment groups (0.312 鹵0.003 and 0.442 鹵0.011, respectively), which was significantly lower than that in control group (0.501 鹵0.011) (P 0.01). The expression of p53 and Bcl-2 in corneal endothelial cells of anti-Caspase-9 pretreatment group was lower than that of anti-Caspase-8 pretreatment group, and the difference was statistically significant (P 0.01). The results showed that anti-Caspase-9 could inhibit the apoptosis of corneal endothelial cells under high pressure. Conclusion Caspase-9 inhibitor can effectively block the apoptosis of corneal endothelial cells induced by high pressure. The injury of high pressure on corneal endothelial cells mainly triggers the release of mitochondrial cytochrome C. Activation of endogenous enzyme-linked reactive apoptosis pathway involved in Caspase-9.
【作者單位】： 南昌大學醫(yī)學院、江西新視界眼科醫(yī)院;中山眼科中心;南昌愛爾眼科醫(yī)院;南昌大學附屬眼科醫(yī)院;
【基金】：國家自然科學基金資助(編號:30801263)~~
【分類號】：R77

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李鳳云,譚星平,楊昌全,周明敏,劉雙珍;正常人角膜內皮細胞密度及形態(tài)化規(guī)律探討[J];中國實用眼科雜志;2001年02期

2 張翠英;劉華;;角膜內皮細胞的損傷及促進其修復的因素[J];醫(yī)學綜述;2007年11期

3 王雅娜;顏偉年;葉宇峰;董映;;外減壓法娩核對角膜內皮細胞的影響[J];實用醫(yī)學雜志;2009年19期

4 潘作新,石珍榮,孫為榮;有關角膜內皮細胞的觀察[J];青島醫(yī)學院學報;1979年02期

5 王東初;角膜內皮細胞[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;1984年05期

6 王麗婭;角膜內皮細胞活性的檢測[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;1997年03期

7 張忠偉;宋彩萍;;超聲乳化白內障吸除術后角膜內皮細胞損傷及修復的臨床分析[J];中國處方藥;2014年06期

8 趙紹貞,孫慧敏,袁佳琴;準分子激光屈光性角膜切削術對角膜內皮細胞的影響[J];眼科研究;2000年02期

9 楊亞波,姚克,杜新華,夏文琴;準分子激光原位角膜磨鑲術后角膜內皮細胞的變化[J];中華眼科雜志;2002年01期

10 王旭,謝立信,史偉云;外源基因轉入角膜內皮細胞的實驗研究[J];中華眼科雜志;2002年02期

相關會議論文 前10條

1 董仰曾;;原發(fā)性閉角型青光眼對角膜內皮細胞的影響[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

2 丁蕾;申家泉;唐俠;;急性閉角型青光眼角膜內皮細胞功能的相關影響因素分析[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

3 史芳榮;劉洛如;杜獻芳;張東魁;;準分子激光原位角膜磨鑲術對角膜內皮細胞的影響[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

4 陳斯;;不同年齡段年齡相關性白內障患者角膜內皮細胞情況研究[A];2011年浙江省眼科學術會議論文集[C];2011年

5 俞頌平;施天嚴;范大軍;陳戰(zhàn)巧;李穎;;白內障超聲乳化術后角膜內皮細胞的研究[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

6 俞頌平;施天嚴;范大軍;王少云;;白內障超聲乳化術后角膜內皮細胞的研究[A];2007年浙江省眼科學術會議論文集[C];2007年

7 徐海銘;洪朝陽;;虹膜固定型PR-IOL植入術矯正高度近視對角膜內皮細胞影響的臨床觀察[A];浙江省中西醫(yī)結合學會眼科專業(yè)委員會第九次學術年會暨省級繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2006年

8 林嬡;徐錦堂;陳建蘇;吳靜;;非促分裂型haFGF對角膜內皮細胞的保護作用[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

9 張少維;邢怡橋;艾明;楊安懷;葉美紅;梅海峰;;硅油取出聯合超聲乳化人工晶體植入術對角膜內皮細胞的影響[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

10 蘇龍;張紅;王鐵成;漆晨;;共聚焦顯微鏡觀察增殖期糖尿病視網膜病變患者玻璃體切割術后角膜內皮細胞的的改變[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

相關博士學位論文 前3條

1 李東侃;人β-神經生長因子基因轉染體外培養(yǎng)貓角膜內皮細胞促進其分裂再生的實驗研究[D];青島大學;2004年

2 羅文娟;人血小板源性生長因子基因B轉染體外培養(yǎng)貓角膜內皮細胞的生物學效應[D];青島大學;2005年

3 宋靜;小分子化合物J2作用于大鼠角膜細胞的體外及體內實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2011年

相關碩士學位論文 前10條

1 熊思盈;不同術式對高度近視合并白內障患者角膜內皮細胞的影響[D];桂林醫(yī)學院;2016年

2 李嫻;急性高眼壓對大鼠角膜內皮細胞屏障功能及泵功能的影響[D];南華大學;2016年

3 王璇;核黃素/紫外線A角膜交聯術對角膜內皮細胞的影響[D];山東大學;2017年

4 胡曉琴;兔角膜內皮細胞壓力仿生培養(yǎng)及調控機制的研究[D];南昌大學;2008年

5 梁玲玲;角膜內皮細胞壓力調控及高壓力損傷機制的研究[D];南昌大學;2010年

6 袁媛;激光對角膜內皮細胞的影響[D];華中科技大學;2007年

7 丁蕾;急性閉角型青光眼患者角膜內皮細胞功能的相關影響因素分析[D];山東大學;2007年

8 賈艷紅;深低溫冷凍保存角膜內皮細胞活性的實驗研究[D];鄭州大學;2007年

9 高彥;人胎兒角膜內皮細胞的體外培養(yǎng)和性質鑒定[D];青島大學;2009年

10 呂明原;急性閉角型青光眼超聲乳化術后角膜內皮細胞的損傷及相關影響因素的研究[D];青島大學;2011年

，

本文編號：2471327