【摘要】：目的：1)觀察新制備的經聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)表面修飾的羥基磷灰石納米載體(hydroxyapatite nanoparticles nHAT)(PEI-nHAT)的生物學性能,評估其體外結合與保護DNA的能力；2)評估攜帶增強型綠色熒光蛋白報告基因(EGFP)及神經營養(yǎng)素3治療基因(NT-3)的PEI-nHAT載體-基因復合物(PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3)經完整圓窗膜途徑向耳蝸轉染的安全性及有效性；3)評估PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3經完整圓窗膜途徑向前庭轉染的安全性及有效性。 方法：1)應用化學共沉淀-水熱合成法制備nHAT,用PEI對其進行表面修飾后,對PEI-nHAT進行透射電鏡觀察并行Zeta電位測定；觀察PEI-nHAT在體外的分散性及穩(wěn)定性；并在不同濃度下觀察其與DNA結合能力以及保護DNA抗核酸酶消化的能力。2)將南美栗鼠分成轉染實驗組、空載體轉染組及生理鹽水對照組三組,將其麻醉后,行枕后徑路打開術耳聽泡,分別將20μl PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3復合物或20μl PEI-nHAT混懸液或20μ1生理鹽水經完整圓窗膜途徑向耳蝸轉染。在手術前及轉染48小時后分別測試雙耳在1kHz、4kHz8kHz、12kHz及16kHz處短純音誘發(fā)的聽性腦干反應(Auditory Brainstem Response, ABR)及畸變產物耳聲發(fā)射(Distortion Product Otoacoustic Emissions, DPOAE)。聽力學檢測完后將動物處死,雙側耳蝸固定、取材,行免疫組織化學、免疫熒光染色、常規(guī)耳蝸鋪片及冰凍切片,應用激光共聚焦熒光顯微鏡進行耳蝸組織學和形態(tài)學觀察及綠色熒光蛋白定位表達觀察。3)將南美栗鼠分成轉染實驗組、空載體轉染組及生理鹽水對照組三組,將其麻醉后,行枕后徑路打開術耳聽泡,分別將20μl PEI-nHAT-pEGFPC2-NT3復合物或20μ1PEI-nHAT混懸液或20μ1生理鹽水經完整圓窗膜途徑向內耳轉染。轉染48小時后將動物處死,雙側內耳前庭器官固定、取材,行免疫組織化學、免疫熒光染色、常規(guī)鋪片及冰凍切片,應用激光共聚焦熒光顯微鏡進行前庭器官組織學和形態(tài)學觀察及綠色熒光蛋白在前庭中的定位表達觀察。 結果：1)PEI-nHAT顆粒在電鏡下形態(tài)為短棒狀,粒徑均勻,分散性及穩(wěn)定性好,其平均粒徑(X±SD)為73.09±27.32nm；在pH為7、濃度為250μg/ml的條件下,PEI-nHAT的Zeta電位(X±SD)為42.46±10.9mV; PEI-nHAT顆粒在125μg/ml-2000μg/ml濃度范圍內都有較好的DNA結合能力,并且PEI-nHAT在上述濃度范圍內均能良好地保護DNA不被DNase I消化。2)各組動物在轉染前及轉染后48小時在1kHz、4kHz、8kHz、12kHz及16kHz處短純音誘發(fā)的ABR閾值無明顯變化,各頻率DPOAE平均幅值差異也無統(tǒng)計學意義(P0.05)�；蜣D染48小時后,各組動物耳蝸內、外毛細胞、血管紋上皮及螺旋神經節(jié)細胞形態(tài)規(guī)則,排列整齊,未見明顯破壞現象；轉染實驗組動物在耳蝸基底膜的外柱細胞區(qū)域、部分血管紋上皮細胞、螺旋神經管內的部分細胞中出現綠色熒光表達,但轉染率不高。3)各組動物術后48小時內均無偏頭、步態(tài)不穩(wěn)、強迫環(huán)繞運動等前庭功能障礙表現。各組動物前庭毛細胞形態(tài)規(guī)則,無缺失,纖毛束排列整齊；周圍支持細胞大小形態(tài)正常。在轉染實驗組中,濃密的綠色熒光信號存在于前庭的暗細胞區(qū)及其過渡細胞區(qū),在橢圓囊斑、球囊斑及壺腹嵴的毛細胞區(qū)域中也出現不同程度的綠色熒光。 結論：1)PEI-nHAT載體表面帶正電荷,其體外的分散性和穩(wěn)定性良好；2)PEI-nHAT載體在體外能有效結合和保護其所攜帶的重組基因質粒免受酶化學物質的破壞；3)完整圓窗膜途徑基因轉染對耳蝸的形態(tài)學及聽力學功能無明顯不良影響,該途徑是進行耳蝸和前庭局部基因轉染的一條安全有效的導入方式；4)前庭暗細胞是PEI-nHAT載體在內耳的一種特異性靶細胞,它可能具有主動攝取PEI-nHAT載體的能力,其原理尚待進一步研究；5)PEI-nHAT是一種具有研究價值的用于內耳基因治療載體的無機納米材料。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R764

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本文編號：2454721