【摘要】：背景和目的 老年黃斑病變(age-related macular degeneration, AMD)是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致不可逆視力損傷的最常見原因，，其中濕性AMD為國內(nèi)外50歲以上人群低視力和致盲的重要原因，發(fā)病率不斷增加。脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularazition, CNV)形成是其危害視功能的主要病理基礎(chǔ)和首要原因。 在觸發(fā)CNV的機制中，VEGF與抗血管生成因子之間的失衡尤為重要。VEGF是一種分泌性蛋白質(zhì)，它可誘發(fā)血管生成，增加血管滲透性，引發(fā)炎癥，而這些因素又與濕性AMD的發(fā)展進程密切相關(guān)。因此，眾多學(xué)者在開發(fā)濕性AMD治療藥物時，都將VEGF當作潛在的治療靶標，比如以適配子或者抗VEGF抗體片段形式出現(xiàn)的哌格太尼、蘭尼單抗、Avastin等。而這些方法存在的問題主要包括不能在患部長效存在，即使應(yīng)用各種緩釋技術(shù)，由于局部微環(huán)境病理性VEGF長時間分泌，因此仍無法滿足抑制VEGF的需求；尤為重要的是這些藥物與VEGF結(jié)合后，由于代謝的困難，存在加重drusen的危險，所以抑制VEGF的產(chǎn)生將比降解或拮抗它更有利于AMD的治療。同時脂褐質(zhì)過載的RPE細胞功能障礙始終是AMD的一個重要的不利因素，在CNV的形成和發(fā)展中起著重要的作用。Bruch’s膜的粗糙，彈力纖維層變薄甚至斷裂，RPE和Bruch’s膜粘附力下降，為CNV的生長提供了有利條件和促進因素，或者是誘因之一。因此，雖然目前血管內(nèi)皮生長因子(vascular enthothelial growth factor，VEGF)抗體和光動力療法等對CNV具有短期療效，但對視功能恢復(fù)作用甚微。目前尚無能同時有效阻抑CNV和修復(fù)脈絡(luò)膜-Bruch’s-RPE膜復(fù)合體的治療措施。 作為一種多功能的細胞外基質(zhì)蛋白，F(xiàn)ibulin5(Fbln5)基因在AMD病程發(fā)展中，尤其在CNV形成過程中發(fā)揮重要作用。首先，在體內(nèi)可調(diào)節(jié)細胞生長、運動及粘附，并且具有明顯抑制新生血管的作用，雖然目前不能完全了解其對抗新生血管形成及VEGF作用的機制，但許多體內(nèi)和體外研究證實了FBLN5可以從多個環(huán)節(jié)中對抗新生血管的形成，并且是通過RGD基序起作用的抑制新生血管形成的機理。其次，F(xiàn)BLN5能防止彈性蛋白病變的發(fā)生，同時充當載脂蛋白A和整合素的配體，F(xiàn)BLN5可通過鈣依賴結(jié)合彈性蛋白的方式，促進彈性纖維組裝并結(jié)合到微纖維系統(tǒng)中。FBLN5缺乏時由于深部彈力纖維結(jié)構(gòu)的破壞，可引起皮膚、肺和脈管系統(tǒng)顯著的異常。FBLN5的這兩個重要作用恰好可以用來從不同環(huán)節(jié)抑制CNV，已有研究表明在眼部FBLN5可由RPE分泌，參與Bruch’s膜及部分玻璃膜疣的組裝。另外，有系列研究發(fā)現(xiàn)在Fbln5基因突變與AMD具有相關(guān)性，并認為是其致病基因之一。Fbln5的突變改變了與彈性蛋白原的連接特性，可能導(dǎo)致Bruch’s膜正常彈性纖維的組裝及穩(wěn)定性異常；同時Fbln5的突變干擾了RPE與Bruch’s膜的正常粘附關(guān)系，這與AMD的血管模型的發(fā)病機制相符。因此，本課題假設(shè)：過表達FBLN5的RPE(Fbln5-RPE)視網(wǎng)膜下移植既能抑制VEGF產(chǎn)生又能補充RPE修復(fù)脈絡(luò)膜-Bruch’s-RPE膜復(fù)合體，可能是治療AMD的新手段。 本研究內(nèi)容是構(gòu)建Fbln5慢病毒表達載體并轉(zhuǎn)染RPE；體外檢測其對脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞(Coroidal Endothelial Cells)增殖、遷移功能的影響及分子機制；將Fbln5-RPE移植到CNV動物模型的視網(wǎng)膜下腔，通過手術(shù)前后眼底血管熒光造影檢測研究對CNV的抑制作用，由此，探討RPE轉(zhuǎn)染Fbln5后移植治療CNV的效果和作用機制。 研究方法 1.應(yīng)用Rat Fbln5全長cDNA質(zhì)粒(pExpress-1-Fbln5)，構(gòu)建pZlen-Fbln5-IRES-GFP慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)Long Evans(LE)大鼠RPE，采用Quantitative real-timePCR(Q-PCR)方法，從基因水平檢測慢病毒FBLN5的過表達。提取培養(yǎng)上清液，進行FBLN5的Western-Blot檢測，檢測分析所構(gòu)建慢病毒FBLN5過表達和分泌至細胞外的能力。 2. Fbln5-RPE對CECs增殖和遷移抑制作用及其機制的研究，實驗分為三組，即單純RPE組(空白對照)、GFP空載轉(zhuǎn)染RPE(GFP-RPE)組(陰性對照)和Fbln5-RPE組(實驗組)。采用Transwell共培養(yǎng)體系將上述三種RPE細胞分別與RF/6A猴脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞系(choroidal endothelial cells，CECs)進行共培養(yǎng)。按遷移模式共培養(yǎng)24小時后，檢測穿透小室底膜的CECs數(shù)量和OD值，研究FBLN5抑制CECs遷移的作用。按增殖模式分別共培養(yǎng)24、48和72小時后，應(yīng)用甲基噻唑基四唑細胞增殖檢測法(Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium, MTT)和流式細胞周期檢測法對Fbln5-RPE抑制CECs增殖的作用進行研究。同時，Q-PCR檢測Fbln5-RPE對共培養(yǎng)CECs中CXCR4，VEGF，TGFB1基因表達的影響，探索其作用機制。 3.建立Long Evans大鼠CNV模型，視網(wǎng)膜下腔移植Fbln5-RPE，研究其抑制體內(nèi)CNV生成的作用，按轉(zhuǎn)染RPE病毒種類的不同分為GFP-RPE組(陰性對照)和Fbln5-RPE組(實驗組)。在移植前和移植后1、2、3、4周分別行眼底血管造影(FundusFluorescein Angiography, FFA)檢查，分析移植前后CNV滲漏面積比值和計數(shù)比值，進行兩組間的統(tǒng)計分析。 結(jié)果 第一部分Fibulin5慢病毒表達載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染RPE的研究 1.成功構(gòu)建pZlen-IRES-Fbln5-GFP慢病毒表達載體，基因測序結(jié)果顯示完全正確，感染RPE的效率在70-80%左右。 2.成功體外原代培養(yǎng)了LE大鼠RPE，純度大于90%，具有富含色素、呈多角形的形態(tài)特點，廣譜角蛋白DAB鑒定陽性，隨著傳代色素會越來越少、形態(tài)梭形變化。 3. Fbln5-RPE中Fbln5表達量是對照組的28倍以上。培養(yǎng)上清液WB檢測發(fā)現(xiàn)FBLN5相對于對照組顯著過表達，并能高效分泌至細胞外。 第二部分Fbln5對脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移的抑制作用及其機制研究 1.體外共培養(yǎng)遷移抑制試驗發(fā)現(xiàn)Fbln5-RPE可顯著抑制CECs遷移透過Transwell小室底膜的數(shù)量(n=5，P 0.01)。而空載體對照組沒有這種效果(n=5， P0.05)。 2.體外共培養(yǎng)第1、2、3天，MTT結(jié)果顯示相對于對照組，F(xiàn)bln5-RPE均可顯著抑制CECs的OD值(n=5，P 0.05)，提示Fbln5-RPE具有抑制CECs增殖的作用。陰性對照組和空白對照組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(n=5， P0.05)。 3.體外共培養(yǎng)第1、2、3天，F(xiàn)bln5-RPE均可顯著抑制CECs細胞S期的比例和細胞增殖指數(shù)，其增殖顯著受到抑制(n=3，P 0.05)，進一步證明Fbln5-RPE抑制CECs增殖的作用。陰性對照組和空白對照組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(n=3， P0.05)。而各個時間點CECs的凋亡系數(shù)三組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(n=3， P0.05)。 4.體外共培養(yǎng)第1、2、3天，Q-PCR發(fā)現(xiàn)相對于兩個對照組，F(xiàn)bln5-RPE下調(diào)了CECs中CXCR4，VEGF，TGFB1基因表達水平，相對表達倍數(shù)統(tǒng)計分析有顯著差異(n=3，P 0.01)，提示Fbln5-RPE下調(diào)CXCR4，VEGF可能是抑制CECs增殖和遷移的作用機制。 第三部分激光誘導(dǎo)CNV模型視網(wǎng)膜下腔移植Fbln5-RPE的體內(nèi)研究 1.成功建立激光誘導(dǎo)LE大鼠CNV模型，1-5周FFA顯示70%左右的激光點有熒光素滲漏，同期眼球冰凍切片可見CNV形態(tài)。 2.移植后1、2、3、4周后， GFP綠色熒光陽性細胞在神經(jīng)視網(wǎng)膜下腔排列成帶狀，并向視網(wǎng)膜層間遷移。移植后第2、3、4周，CNV滲漏面積比值和CNV數(shù)量比值，實驗組均低于對照組(n=3，P 0.05)，提示Fbln5-RPE視網(wǎng)膜下腔移植有抑制CNV的作用。 全文結(jié)論與學(xué)術(shù)意義 1.成功構(gòu)建pZlen-Fbln5-IRES-GFP慢病毒表達系統(tǒng)并率先應(yīng)用到眼科新生血管性疾病的研究中。充分利用了慢病毒長期、高效和整合基因組的優(yōu)點，為進一步的實驗尤其是需要較長期觀察的體內(nèi)試驗提供了有利條件。實驗結(jié)果分別從基因水平和蛋白水平證明了FBLN5能高效表達于RPE細胞并且分泌至細胞外，為進一步的共培養(yǎng)實驗和體內(nèi)移植實驗提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。 2.應(yīng)用Transwell共培養(yǎng)體系，從基質(zhì)膠遷移實驗、MTT、細胞周期、增殖指數(shù)和凋亡系數(shù)等多個層面充分證實了Fbln5-RPE能顯著抑制共培養(yǎng)CECs的增殖和遷移，并發(fā)現(xiàn)其作用機制可能是通過下調(diào)共培養(yǎng)CECs中VEGF和CXCR4表達來實現(xiàn)。本研究提示Fblin5-RPE可能具有抗CNV形成的作用。 3.成功建立激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型，將Fbln5-RPE移植于動物模型視網(wǎng)膜下腔，率先發(fā)現(xiàn)Fbln5-RPE可顯著降低CNV熒光素滲漏面積和減少CNV數(shù)量，證實了Fbln5-RPE移植可抑制CNV生成。綜合體外和體內(nèi)試驗結(jié)果，本研究提示Fbln5-RPE移植為臨床治療CNV提供了一定的理論基礎(chǔ)，有望成為一種治療CNV性AMD的新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R773.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙世紅,何守志;氪激光誘導(dǎo)的大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型研究[J];中華眼科雜志;2003年05期

本文編號：2441252