【摘要】：研究背景感音神經(jīng)性聾是一種較為常見的聲波感受和聲波傳導(dǎo)障礙性疾病,多為重度耳聾。該病的病變常常發(fā)生于柯蒂氏器的內(nèi)外毛細(xì)胞、聽神經(jīng)及各級(jí)聽中樞,患者對(duì)于聲音的感受與神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)發(fā)生障礙,從而引起聽力的下降。感音神經(jīng)性耳聾極大的影響了患者的生活質(zhì)量。感音神經(jīng)性耳聾分為感音性耳聾(病變位于毛細(xì)胞,又稱耳蝸性聾)和神經(jīng)性耳聾(病變位于聽神經(jīng)及其傳導(dǎo)通路,又稱蝸后性聾)。蝸后性耳聾由于神經(jīng)細(xì)胞的缺乏自我修復(fù)的能力而很難治愈。對(duì)于感音神經(jīng)性聾的恢復(fù)策略,最新的探索表明干細(xì)胞植入是潛在的治療手段。干細(xì)胞具有多向分化能力,有分化為新的毛細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和支持細(xì)胞的潛能。許多研究都表明,Wnt信號(hào)通路對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖發(fā)揮著決定性作用。并且,Wnt信號(hào)通路的激活有可能可以使非神經(jīng)元細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞,這就使得治療蝸后性聾成為了可能。Wnt信號(hào)通路是一種在進(jìn)化中高度保守的信號(hào)通路,在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌的與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,激活下游的信號(hào)通路,調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)從而影響著極細(xì)胞、干細(xì)胞等的細(xì)胞增殖、分化與凋亡的過程。通路的異常激活往往與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Wnt信號(hào)通路分為兩種,經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路。β-連環(huán)蛋白的富集與入核是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活的標(biāo)志。β-連環(huán)蛋白入核后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)。而非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路,不依賴于β-連環(huán)蛋白,是由其他的一些蛋白或離子參與構(gòu)成。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺失可引起神經(jīng)性耳聾的發(fā)生。而有大量研究表明,耳毒性藥物、噪聲、缺氧、衰老等常見損傷,均可造成小鼠耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡,造成耳聾。而目前對(duì)于耳毒性藥物的研究,較多集中在順鉑等藥物。紫杉醇由于其與順鉑常常聯(lián)合使用,其耳毒性往往為順鉑所掩蓋,研究較少。而研究也表明紫杉醇確實(shí)具有神經(jīng)毒性,可以猜測(cè)紫杉醇的耳毒性是對(duì)耳的神經(jīng)細(xì)胞造成了影響。螺旋神經(jīng)節(jié)作為聽覺通路的第一級(jí)神經(jīng)元,有理由懷疑紫杉醇對(duì)于螺旋神經(jīng)節(jié)有損傷作用而這一作用正是它耳毒性的原因。本研究通過組織培養(yǎng)的方式來探究紫杉醇對(duì)于螺旋神經(jīng)節(jié)是否具有獨(dú)立的損傷作用,并探討Wnt信號(hào)通路對(duì)于紫杉醇的作用是否具有一定的影響。實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊訡57BL/6小鼠作為研究對(duì)象,探討紫杉醇本身是否對(duì)小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生獨(dú)立的損傷作用,若有損傷,則進(jìn)一步探討其機(jī)制及Wnt信號(hào)通路在此過程中的作用。實(shí)驗(yàn)方法1.選取出生后3天(p3)野生型的C57BL/6品系小鼠為研究對(duì)象,取小鼠耳蝸中轉(zhuǎn)(帶螺旋神經(jīng)節(jié))分組進(jìn)行原代培養(yǎng)。2.分別使用不同濃度紫杉醇培養(yǎng),利用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活程度,并選取合適濃度進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。將小鼠耳蝸中轉(zhuǎn)隨機(jī)分為四組,分別使用培基(不加藥的空白對(duì)照)、紫杉醇、紫杉醇+Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑(Wnt3a)、紫杉醇+Wnt信號(hào)通路抑制劑(IWP2)來處理中轉(zhuǎn)(帶螺旋神經(jīng)節(jié))48h,之后分別進(jìn)行免疫熒光染色和TUNEL染色,觀察螺旋神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)纖維的變化。使用蛋白印跡試驗(yàn)(Westernblot)來印證免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.紫杉醇腹腔注射一月齡小鼠,測(cè)聽后解剖,取耳蝸制作冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色,觀察螺旋神經(jīng)節(jié)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.MTT結(jié)果顯示,1μl紫杉醇即可造成細(xì)胞存活率的下降,紫杉醇對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷呈現(xiàn)濃度依賴,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用30μl濃度進(jìn)行。免疫熒光染色顯示,紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)胞數(shù)量減少,神經(jīng)纖維數(shù)量減少。2.免疫熒光染色顯示紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)破壞,出現(xiàn)了胞質(zhì)致密,染色質(zhì)邊集,核固縮及凋亡小體等凋亡表現(xiàn)。而TUNEL染色證實(shí)了凋亡的存在。3.免疫熒光染色顯示紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase-3染色陽性。蛋白印跡試驗(yàn)也證實(shí)了 Caspase-3的表達(dá)增多。4.加入Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量介于對(duì)照組和紫杉醇組之間,形態(tài)較紫杉醇組稍好,神經(jīng)纖維基本整齊排列。加入抑制劑組螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,細(xì)胞數(shù)量大量少,形態(tài)破壞較為嚴(yán)重,凋亡明顯,神經(jīng)纖維破壞嚴(yán)重。5.腹腔注射紫杉醇造模后的一月齡小鼠測(cè)聽結(jié)果顯示與正常一月齡小鼠并無顯著差別,但冰凍切片顯示耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞存在損傷和凋亡。結(jié)論1.紫杉醇對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有明顯損傷作用。2.損傷作用通過激活Caspase-3,誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)。3.Wnt信號(hào)通路對(duì)于紫杉醇的損傷具有一定的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R764.43

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本文編號(hào)：2401211