【摘要】：慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis,CRS)是耳鼻咽喉頭頸外科的常見多發(fā)病,是鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎性疾病,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。CRS的發(fā)病是多種致病因素交叉作用的結(jié)果,致病菌感染是其中重要因素之一。細菌生物膜是不同于游離菌的另一種細菌存在形式,由細胞外保護性基質(zhì)和包裹其中的細菌群落組成,是具有一定空間構(gòu)型的高度組織化的結(jié)構(gòu)。生物膜形成后,細菌對宿主免疫及抗生素類藥物的抵抗較游離菌大大增強。據(jù)估計,約65%的人類慢性細菌性感染與生物膜有關(guān)。細菌生物膜在CRS患者鼻腔鼻竇黏膜表面的檢出率約為30-80%,可能是加重CRS病情的重要因素。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌是成人CRS的重要致病菌,目前認為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜形成與CRS重癥化和難治化之間存在相關(guān)性。固有免疫是機體抵御環(huán)境微生物的第一道防線。溶菌酶,分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(secretory leukocyte proteinase inhibitor,SLPI)和糖蛋白340(glycoprotein 340,gp340)是鼻腔黏膜固有免疫應答的重要蛋白,分別在識別,調(diào)控,殺菌等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。目前不同生物膜狀態(tài)的CRS中溶菌酶,SLPI和gp340的表達情況未見報道;國內(nèi)外關(guān)于溶菌酶,SLPI和gp340對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜的效應研究較少。為此我們通過在臨床收集CRS患者鼻竇黏膜標本及在體外建立鼻竇黏膜離體組織模型和金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌生物膜模型,采用免疫組化,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),Western blot,熒光標記和激光共聚顯微鏡觀察等手段,就細菌生物膜對鼻竇黏膜溶菌酶,SLPI和gp340表達的調(diào)控以及溶菌酶,SLPI和gp340對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜的抑制進行實驗研究;以初步闡明細菌生物膜與上述固有免疫相關(guān)分子之間的相互作用,為進一步研究CRS中細菌生物膜影響宿主固有免疫可能的機制奠定基礎(chǔ),也為探索CRS新的治療途徑提供思路。本研究由以下三部分組成:第一部分:溶菌酶,SLPI和gp340在細菌生物膜相關(guān)慢性鼻-鼻竇炎中的表達目的:探討溶菌酶,SLPI和gp340在具有不同細菌生物膜狀態(tài)的慢性鼻-鼻竇炎患者鼻竇黏膜的表達情況。方法:收集CRS患者63名和對照組腦脊液鼻漏患者20名的篩竇黏膜樣本,以激光共聚顯微鏡觀察鼻竇黏膜樣本表面細菌生物膜情況,分別以RT-PCR,免疫組化和Western blot檢測溶菌酶,SLPI和gp340在鼻竇黏膜中的表達。結(jié)果:35/63(55.6%)的CRS患者細菌生物膜陽性,對照組未檢出細菌生物膜。CRS患者溶菌酶,SLPI和gp340的m RNA和蛋白表達水平均較對照組上調(diào);細菌生物膜陽性CRS患者溶菌酶,SLPI和gp340的m RNA和蛋白表達水平較細菌生物膜陰性的CRS患者增強。結(jié)論:溶菌酶,SLPI和gp340在鼻竇黏膜中呈組成性表達,CRS患者溶菌酶,SLPI和gp340在m RNA和蛋白水平的表達上調(diào)與細菌生物膜有關(guān),CRS中細菌生物膜和固有免疫應答的改變密切相關(guān)。第二部分:金黃色葡萄球菌生物膜對人離體鼻竇黏膜溶菌酶,SLPI和gp340表達的影響目的:探討不同表型金黃色葡萄球菌對人離體鼻竇黏膜組織溶菌酶,SLPI和gp340表達的影響。方法:采集10例經(jīng)鼻內(nèi)鏡腦脊液鼻漏修補術(shù)患者的篩竇黏膜進行離體組織培養(yǎng)并建立金黃色葡萄球菌游離菌和生物膜感染模型。以激光共聚顯微鏡確認模型建立成功,分別在建模后8小時,16小時及24小時以ELISA法測定溶菌酶,SLPI和gp340分泌水平;24小時后以RT-PCR,免疫組化和Western blot法檢測培養(yǎng)組織中溶菌酶,SLPI和gp340的m RNA和蛋白表達水平。結(jié)果 金黃色葡萄球菌游離菌和生物膜刺激溶菌酶,SLPI和gp340在離體鼻黏膜組織模型中表達上調(diào)的水平不同;模型中溶菌酶,SLPI和gp340的分泌水平呈現(xiàn)時間依賴趨勢。結(jié)論:金黃色葡萄球菌生物膜較游離菌更能誘導溶菌酶,SLPI和gp340在鼻竇黏膜組織中高表達,是影響宿主固有免疫的重要因素。第三部分:溶菌酶,SLPI和gp340對體外金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜的作用目的:通過體外實驗研究溶菌酶,SLPI和gp340對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜的作用。方法:體外培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌參考株及臨床分離株,不同方法建立細菌生物膜體外模型。分別在細菌生物膜形成的不同階段用不同濃度的溶菌酶,SLPI和gp340進行干預;以結(jié)晶紫染色,Baclight染色,alamar Blue檢測和激光共聚顯微鏡觀察分析干預效果。結(jié)果:溶菌酶,SLPI和gp340在體外對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌和生物膜有不同程度的殺傷作用;兩種蛋白聯(lián)合的抗菌與抗生物膜效應較單一蛋白顯著增強。結(jié)論 生物膜形成是細菌抵抗機體免疫反應的重要機制;溶菌酶,SLPI和gp340是重要的抗菌蛋白,在固有免疫應答中互相配合發(fā)揮效應。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R765.21

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本文編號：2377853