【摘要】：研究背景和意義視網膜新生血管性疾病是危害視力,致盲的重要疾病之一。目前普遍認為視網膜局部缺氧狀態(tài)是誘導視網膜新生血管形成的主要原因之一,其發(fā)病機制研究是國內外的研究熱點。研究證實缺氧刺激下多種轉錄因子活性增加可促進微血管內皮細胞活化,導致新生血管形成,其中除血管內皮生長因子(VEGF)外,特殊蛋白1(SP1)和缺氧誘導因子1-α(HIF1-α)的血管生成作用也逐漸受到關注。近幾年研究發(fā)現,VEGF的啟動子上存在SP1和HIF1-α結合位點,從而可被其調控引起轉錄增強;除此之外,課題組研究發(fā)現,缺氧誘導下腺苷水平與人微血管內皮細胞(HMEC-1)的活化相關,而SP1和HIF1-α已被證實可以調節(jié)腺苷生成的關鍵核苷酸酶:三磷酸腺苷酶(CD39)和5′核苷酸酶(CD73)。本課題希望通過證實同時干擾SP1和HIF1-α基因可以較單基因干擾SP1/HIF1α或傳統(tǒng)抗VEGF藥物(雷珠單抗注射液),更能有效抑制人微血管內皮細胞(HMEC-1)活化,從而為進一步治療視網膜新生血管性疾病提供新的方法。目的:1、證實缺氧誘導模型下,HMEC-1細胞株SP1和HIF1-α表達水平增高,且通過單因素或雙因素siRNA干擾能成功抑制缺氧下細胞內SP1或/和HIF1-α的表達。2、證實聯合干擾較單因素干擾是否更能有效抑制缺氧誘導下的HMEC-1細胞株活化效應。3、證實聯合干擾效應是否是通過抑制VEGF促血管內皮細胞活化通路的同時抑制CD39和CD73激活腺苷促血管內皮細胞活化通路而產生。4、證實聯合干擾較臨床抗VEGF藥物(雷珠單抗注射液)是否更能有效抑制缺氧誘導下的HMEC-1細胞株活化效應。方法:1、將實驗分為缺氧組(缺氧培養(yǎng)箱:37℃,體積分數1%O2,94%N2和5%CO2)和常氧組(常氧培養(yǎng)箱:37℃,體積分數5%CO2),培養(yǎng)時間分別為12小時和24小時,通過Western blot法檢測缺氧誘導模型下人HMEC-1細胞株SP1和HIF1-α表達水平,是否高于常氧狀態(tài);再通過該檢測法驗證單因素或聯合siRNA干擾是否能成功抑制缺氧下HMEC-1細胞株SP1或/和HIF1-α的表達。2、將實驗分為缺氧組、常氧組、si RNA-Control組(Control-si)、siRNA-SP1組(SP1-si)、siRNA-HIF1-α組(HIF1-α-si)、siRNA-聯合干擾組(SP1-si+HIF1-α-si),培養(yǎng)時間為24小時,通過細胞計數試劑盒-8(CCK8),EDU法和Transwell法,比較SP1或HIF1-α單因素干擾以及SP1和HIF1-α聯合干擾對缺氧誘導下的HMEC-1細胞株活化的抑制效應。3、將實驗分為si RNA-Control組、si RNA-SP1組、si RNA-HIF1-α組、si RNA-聯合干擾組,缺氧下培養(yǎng)24小時,通過Western blot法和免疫熒光法,觀察聯合干擾對VEGF促血管內皮細胞活化通路的抑制以及CD39和CD73激活腺苷促血管內皮細胞活化通路的抑制作用。4、將實驗分為si RNA-聯合干擾組、抗VEGF組(0.5mg/ml雷珠單抗注射液),缺氧下培養(yǎng)24小時,通過細胞計數試劑盒-8(CCK8),EDU法和Transwell法,比較SP1和HIF1-α聯合干擾以及傳統(tǒng)抗VEGF藥物(雷珠單抗注射液)對缺氧誘導下的HMEC-1細胞株活化的抑制效應。結果:1、缺氧模型中,HMEC-1細胞株SP1和HIF1-α表達水平高于常氧組,且隨時間增加,表達量增加;在HMEC-1細胞株加入SP1或/和HIF1-αsi RNA可有效抑制缺氧下其在細胞內的表達。2、缺氧模型中,HMEC-1細胞株活化效應高于常氧組;且對缺氧誘導下的HMEC-1細胞株活化的抑制效應,siRNA-聯合干擾組高于si RNA-SP1組和siRNA-HIF1-α組;3、缺氧模型中,加入SP1或/和HIF1-αsiRNA后,可以有效抑制HMEC-1細胞株中的VEGF表達,以及CD39、CD73和腺苷的表達,且抑制效應si RNA-聯合干擾組高于si RNA-SP1組和si RNA-HIF1-α組。4、缺氧模型中,siRNA-聯合干擾組對HMEC-1細胞株活化效應的抑制作用較抗VEGF組(0.5mg/ml雷珠單抗注射液)更明顯。結論:上述結果顯示,缺氧誘導下,HMEC-1細胞株中SP1和HIF1-α表達水平增高,加入si RNA干擾SP1或/和HIF1-α基因,可通過抑制細胞中的VEGF表達以及CD39、CD73和腺苷的表達,使細胞活化效應明顯降低,且聯合干擾效應較單因素干擾效應以及傳統(tǒng)抗VEGF(0.5mg/ml雷珠單抗注射液)抑制更明顯。因此我們認為,SP1和HIF1-α基因對缺氧狀態(tài)下人微血管內皮細胞活化有重要作用,可進一步研究雙靶點干擾效應,使之成為治療視網膜新生血管性疾病的新治療方式。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R774.1

【參考文獻】

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1 郎敏;袁容娣;陳春林;霍妍;鄒歡;葉劍;;增殖性糖尿病視網膜病變患者玻璃體腺苷濃度和增殖膜中CD73表達的研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2013年10期

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本文編號：2357605