【摘要】：研究背景 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方最常見的惡性腫瘤之一,絕大多數(shù)NPC分化差,惡性程度高,易早期發(fā)生頸淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移。目前,鼻咽癌的臨床治療主要以放療和化療為主,5年生存率約50%-70%之間。中晚期NPC臨床療效差,再加上在鼻咽癌治療過程中往往會出現(xiàn)多藥耐藥性(multi-drug resistance, MDR),而導致化療失敗。因此,研究鼻咽癌耐藥的分子機制很有必要。 MDR是指惡性腫瘤細胞在接觸一種抗癌藥后,產(chǎn)生了對多種結(jié)構(gòu)不同、作用機制各異的其他抗癌藥的耐藥性。MDR是惡性腫瘤化療失敗和復發(fā)的重要原因之一,涉及到多種復雜的分子機制,其中,以多藥耐藥相關(guān)蛋白(multi-drug resistance protein, MRP)在抗癌藥物耐藥中所起的作用備受重視。 比較耐藥腫瘤細胞與其對應的親本腫瘤細胞之間差異表達的蛋白質(zhì),可以發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì),為篩選腫瘤耐藥的分子標志物及腫瘤耐藥的靶向治療提供了新的研究方向。 第一章鼻咽癌順鉑耐藥細胞系的建立 目的：本研究通過順鉑(cis-Diammine-Dichloro-Platinum, cDDP)濃度遞增法建立了鼻咽癌耐藥的細胞株CNE2/cDDP,并研究其生物學行為。方法：采用cDDP濃度遞增法,經(jīng)過3個月左右的時間建立了鼻咽癌順鉑耐藥細胞系CNE2/cDDP,倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察,MTT檢測不同細胞系的耐藥性。結(jié)果：MTT實驗研究發(fā)現(xiàn)在不同藥物(順鉑、長春新堿、卡鉑、紫杉醇、5-FU)作用下,CNE2/cDDP較CNE2的IC50值及耐藥指數(shù)均有明顯的增加,CNE2/cDDP細胞對順鉑的耐藥性最強,增加到200.6倍,對5-Fu的耐藥性最差,增加到2.8倍；耐藥細胞株CNE2/cDDP較非耐藥細胞株CNE2生長速度減慢,其細胞倍增時間由18小時增加到24小時；CNE2/cDDP細胞體積較CNE2為小,常呈克隆聚集現(xiàn)象。結(jié)論：CNE2/cDDP不光對順鉑具有耐藥性,對其他化療藥物也具有不同的耐藥性,即具有MDR,并且該細胞系性狀穩(wěn)定,可穩(wěn)定地傳代和保存,是一個理想的用于鼻咽癌的多藥耐藥研究的細胞系,為下一步蛋白質(zhì)組學研究提供了基礎(chǔ)。 第二章鼻咽癌順鉑耐藥細胞系的耐藥蛋白質(zhì)組學研究及耐藥關(guān)鍵蛋白功能研究 目的：本研究通過蛋白質(zhì)組學方法分離鑒定鼻咽癌耐藥細胞系的差異表達蛋白,并對其中的關(guān)鍵蛋白keratin1進行功能研究,以揭示keratin1在鼻咽癌耐藥中的作用。方法：采用2-DE+MALDI-TOF-MS進行鑒定,獲得了鼻咽癌順鉑耐藥的差異表達譜；并對其中的三個關(guān)鍵耐藥蛋白(KRT1,CTSD,ANXA5)表達水平進行western blot驗證;通過siRNA干擾KRT1表達后,觀察KRT1與鼻咽癌耐藥性的關(guān)系。結(jié)果：蛋白質(zhì)組學方法獲得了鼻咽癌細胞株CNE2與其順鉑耐藥細胞株CNE2/cDDP的差異蛋白表達譜,并鑒定了其中的17個差異表達蛋白,包括：角蛋白1,角蛋白18,膜聯(lián)蛋白A5,組織蛋白酶D, cDNA FLJ52723, NME2(轉(zhuǎn)移抑制蛋白),3,2-反式-烯酰輔酶A異構(gòu)酶,組蛋白2B,熱休克蛋白p-1,3-羥氨基-輔酶a脫氫酶-2,丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶,谷氨酸脫氫酶1,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運ATPase, α-烯醇酶,熱休克蛋白90a,NADH脫氫酶,核內(nèi)核糖體蛋白C1/C2等。這些蛋白功能涉及到：細胞骨架,基因組穩(wěn)定,分子伴侶,代謝相關(guān)酶,轉(zhuǎn)運相關(guān)信號通路,蛋白合成和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路等。其中三個蛋白KRT1,CTSD, ANXA5在耐藥細胞株中CNE2/cDDP中的表達水平均明顯上調(diào),與蛋白質(zhì)組學鑒定的結(jié)果是一致的,說明蛋白質(zhì)組學方法鑒定獲得的差異蛋白表達譜是可靠的;keratin1在CNE2/cDDP中表達高于CNE2, siRNA下調(diào)keratin1表達后,可以顯著性減少鼻咽癌細胞株對五種化療藥物的IC50值,增加鼻咽癌細胞對化療藥物的敏感性；當siRNA下調(diào)keratin1表達后,多藥耐藥蛋白(MRP)的表達也下調(diào),說明keratin1表達與MRP表達具有相關(guān)性；keratin1表達下調(diào)引起鼻咽癌細胞中MRP表達下調(diào),從而引起鼻咽癌細胞的耐藥性降低。結(jié)論：1.2-DE結(jié)合質(zhì)譜獲得了鼻咽癌順鉑耐藥的差異蛋白表達譜；2.獲得了17個與鼻咽癌順鉑耐藥有關(guān)的差異表達蛋白,這些蛋白功能涉及到細胞骨架、基因組穩(wěn)定、分子伴侶、代謝相關(guān)酶、轉(zhuǎn)運相關(guān)信號通路、蛋白合成和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路等；3.KRT1,CTSD,ANXA5經(jīng)驗證與鼻咽癌順鉑耐藥有關(guān)；4. KRT1表達下調(diào)可導致鼻咽癌細胞株對順鉑、長春新堿、卡鉑、紫杉醇、5-FU的耐藥性減低；降低KRT1可導致化療藥物的耐藥性降低；5.鼻咽癌順鉑耐藥的分子機制可能與KRT1通過下調(diào)MRP表達有關(guān)。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 謝宗佑,孫保存,郝希山;大腸癌組織蛋白酶D表達與臨床病理因素和預后的關(guān)系[J];天津醫(yī)科大學學報;2004年01期

2 姜潤德,張立新,岳文,朱運峰,路浩軍,劉昕,岑信棠,關(guān)新元,李春海;人鼻咽癌順鉑耐藥細胞系(CNE2/DDP)的建立及耐藥相關(guān)基因的篩選[J];癌癥;2003年04期

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