【摘要】：研究背景及目的:AMD (age-related macular degeneration,年齡相關性黃斑變性)其臨床特點之一是玻璃膜疣的形成。RPE (retinal pigment epithelial,視網膜色素上皮細胞)是AMD研究的核心細胞。玻璃膜疣的重要組份之一——CLU(clusterin,叢生蛋白)能保護RPE細胞免受氧化應激所致凋亡。體內非編碼RNA中具有重要功能的包括 miRNA (microRNAs,小 RNA)和 lncRNA (long noncoding RNAs,長鏈非編碼RNA)。這兩者均參與了體內基因表達修飾及調控過程。然而,在CLU作用下的RPE細胞中,其下游特定的miRNA及l(fā)ncRNA出現(xiàn)怎樣的改變,目前尚不清楚。希望通過本研究闡明CLU對RPE細胞穩(wěn)定性的影響,觀察CLU作用下RPE細胞中mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA差異表達變化,構建lncRNA-mRNA-miRNA基因調控網絡進行功能性驗證和分析。方法·①MTT法檢測CLU作用下人RPE細胞株D407細胞穩(wěn)定性。②高通量測序法檢測CLU作用下D407細胞中mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA表達差異。③構建lncRNA-mRNA-miRNA相關基因調控網絡,篩選目標靶基因并對其進行驗證。④建立Aβ25-35誘導的RPE細胞毒性模型,采用Western blot和RT-PCT的方法研究目標靶基因hsa-miR-1273g-3p參與AMD可能的發(fā)病機制。結果:①CLU的任一濃度和時間均不會給D407細胞的活力和增殖帶來負面作用,也不影響RPE細胞的生存力。②mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA表達差異檢測結果:經CLU處理后RPE細胞中總共有321個基因表達呈現(xiàn)差異,其中有71個基因表達升高,250個基因表達降低;有36個miRNA呈現(xiàn)異常表達。與對照組對比,經CLU處理后的實驗組中共檢測出296個已知lncRNA和90個新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。經分析,共有66對差異表達的miRNA-mRNA。其中大部分是多個目標靶基因與一個miRNA相對應,個別是一個目標靶基因只與一個miRNA相連的單一對應關系。③構建ceRNA基因網絡:篩選出代表性差異基因并對其進行了驗證,包括:靶基因EN(engrailed,同源盒蛋白轉錄因子)1、EN2、EDN2(endothelin2,人內皮素2)、MYLIP (myosin regulatory light chain interacting protein,肌球蛋白調節(jié)輕鏈相互作用蛋白)和 C5AR2 (complement component 5areceptor 2,補體成分 5a 受體 2 基因);lncRNA NR_036461 (HIST2H2BC)和 NR_02376 (TOPORS-AS1) ; miRNA hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-5582-3p 和 hsa-miR-1293。其中,hsa-miR-1273g-3p 與炎癥反應密切相關。④建立Aβ25-35誘導的RPE細胞毒性模型,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-1273g-3p能調控Aβ25-35寡聚體誘導的RPE細胞毒性模型中炎癥反應相關因子如 MMP-2 (matrixmetalloproteinase-2,基質金屬蛋白酶 2)、MMP-9 和 TNF-α(tumour necrosis factor α,腫瘤壞死因子αα)的基因轉錄和蛋白表達水平,hsa-miR-1273g-3p能調控自體吞噬相關蛋白酶的表達,從而調控溶酶體介導的自體吞噬途徑,進而參與AMD發(fā)生機制。結論:本研究分析了 CLU作用下RPE細胞中mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA差異表達變化,篩選出代表性差異表達基因并進行了驗證。其中最重要的與炎癥反應相關的基因是hsa-miR-1273g-3p。通過建立Aβ25-35誘導的RPE細胞毒性模型,首次研究了 hsa-miR-1273g-3p參與AMD發(fā)生及RPE細胞損傷機制,這為進一步研究AMD發(fā)病機制及探求新的治療靶點提供了理論基礎。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R774.5

【參考文獻】

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1 Yun-Mi Jeong;Tae-Eun Jin;Jung-Hwa Choi;Mi-Sun Lee;Hyun-Taek Kim;Kyu-Seok Hwang;Doo-Sang Park;Hyun-Woo Oh;Joong-Kook Choi;Vladimir Korzh;Melitta Schachner;Kwan-Hee You;Cheol-Hee Kim;;Induction of clusterin Expression by Neuronal Cell Death in Zebrafish[J];Journal of Genetics and Genomics;2014年11期

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本文編號：2309132