發(fā)布時間：2018-11-02 18:20

【摘要】：目的角膜堿燒傷是常見的、治療較為棘手的角膜外傷,堿燒傷后不同的臨床階段,組織反應不同。急性期以炎癥反應為特征,早期修復期以上皮細胞、基質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)的修復為主;目前臨床上治療堿燒傷多采用抗炎、抑制免疫反應、角膜移植等方法,但療效不甚理想。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells BMSCs)是一種具有高度自我更新能力、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性的成體干細胞。BMSCs能夠合成分泌多種細胞因子,并可通過旁分泌效應促進受損細胞或組織修復。目前國內(nèi)外研究已經(jīng)證明BMSCs能夠促進堿燒傷后角膜修復,但由其分泌的細胞因子的治療作用,尚待進一步研究證明。本課題通過建立大鼠角膜堿燒傷模型,探討骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液(Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium MSC-CM)在堿燒傷后角膜上皮愈合、角膜混濁程度、組織炎癥反應、基質(zhì)纖維化、細胞增殖和凋亡中的作用。方法1.建立大鼠角膜堿燒傷模型:將直徑4mm的單層濾紙片在1mol/L NaOH溶液中浸泡后,貼附于角膜中央10秒,損傷后治療組給予MSC-CM局部點眼,對照組給予磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffer Saline PBS)點眼,大鼠飼養(yǎng)周期為14天,比較不同時間點兩組角膜修復情況;2.裂隙燈觀察堿燒傷后大鼠眼表的變化情況:分別于堿燒傷后12小時、24小時、48小時、3天、5天、7天、10天、14天,觀察角膜上皮愈合情況,并計算上皮缺損面積百分比(熒光素鈉染色,鈷藍光下觀察);分別于堿燒傷后48小時、3天、5天、7天、10天、14天,觀察中央角膜混濁度,并根據(jù)Fantes評分系統(tǒng)進行評分;3.組織病理學檢查:分別于堿燒傷后12小時、24小時、48小時、3天、7天、14天,通過HE染色觀察損傷后角膜組織形態(tài)學改變及炎癥細胞浸潤情況;分別于堿燒傷后24小時、48小時、3天、7天、14天,通過免疫組織化學染色,觀察堿燒傷后大鼠角膜細胞增殖(PCNA)、基質(zhì)纖維化(α-SMA)及細胞凋亡(Caspase-3)情況,并對陽性細胞進行計數(shù);4.實時定量-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR):分別于堿燒傷后12小時、24小時、48小時、3天、7天、14天,通過RT-PCR檢測不同時間點炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-10)、基質(zhì)纖維化因子(α-SMA、Collage-Ⅲ、Collage-Ⅰ)、細胞增殖因子(PCNA)、細胞凋亡因子(Bax、Bcl_2、Caspase-3)的基因表達情況。結(jié)果1.堿燒傷后24小時、48小時、3天、5天、7天,MSC-CM治療組角膜上皮缺損面積百分比小于PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),MSC-CM治療組角膜上皮于損傷后第7天完全愈合,PBS對照組角膜上皮于損傷后第10天完全愈合;堿燒傷后48小時、3天、5天、7天、10天,兩組角膜混濁度評分比較,差異沒有統(tǒng)計學意義,MSC-CM治療組于損傷后第10天角膜完全透明,PBS對照組于損傷后第14天角膜完全透明;2. HE染色結(jié)果:堿燒傷后24小時、48小時、3天、7天,MSC-CM治療組角膜上皮細胞層數(shù),基質(zhì)水腫程度,膠原纖維排列規(guī)整程度均優(yōu)于PBS對照組,基質(zhì)炎癥細胞計數(shù)均少于PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);3.免疫組織化學染色結(jié)果:堿燒傷后24小時、48小時、3天、5天、7天,PCNA陽性細胞計數(shù)MSC-CM治療組均多于PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);堿燒傷后24小時、48小時、3天、5天、7天、14天,α-SMA陽性細胞計數(shù)MSC-CM治療組均少于PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);堿燒傷后4小時、48小時、3天、5天、7天,Caspase-3陽性細胞計數(shù)MSC-CM治療組均少于PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);4. RT-PCR結(jié)果:堿燒傷后12小時、24小時、48小時、3天、7天,MSC-CM治療組 TNF-α (P0.01)、IL-6 (P0.05)、α-SMA (P0.001)、Collage-Ⅲ(P0.01)、Bax (P0.01)、Caspase-3 (P0. 001)基因表達水平低于 PBS對照組,IL-10 (P0.05)、PCNA (P0.001)、Collagen-Ⅰ (P0.001)、Bcl_2(P0.01)基因表達水平高于PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。堿燒傷后第14天,MSC-CM治療組TNF-α、Bax、Caspase-3、Bc12基因表達水平與PBS對照組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義;IL-6 (P0.05)、α-SMA (P0.001)、Collage-111 (P0.01)基因表達水平仍低于 PBS 對照組,IL-10 (P0.05)、PCNA (P0.001)、Collagen-Ⅰ (P0.001)基因表達水平仍高于PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論1. MSC-CM能夠促進堿燒傷后角膜上皮修復,加快上皮愈合速度;2. MSC-CM能抑制堿燒傷后角膜組織的炎癥反應,這可能與其能夠抑制炎癥因子TNF-α和IL-6基因表達,同時促進抗炎因子IL-10基因表達有關(guān);3. MSC-CM能抑制堿燒傷后角膜基質(zhì)纖維化,這可能與其能夠抑制α-SMA和Collagen-Ⅲ基因和蛋白表達,同時促進Collagen-Ⅰ基因表達有關(guān);4. MSC-CM能夠抑制堿燒傷后角膜細胞凋亡,這可能與其能夠促進凋亡抑制基因Bc12基因表達,并抑制凋亡誘導基因Bax、Caspase-3基因/蛋白表達有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R779.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 呂佳惠;姜敏敏;石慧;李建遠;杜振寧;;過氧化物酶6對紫外線致大鼠角膜損傷的治療作用及機制[J];中國藥科大學學報;2016年01期

2 黃科昌;楚云超;鄭觀榮;李娜;王德偉;劉偉偉;;caspase-3在多塞平誘導大鼠神經(jīng)細胞凋亡中的作用[J];中華麻醉學雜志;2016年01期

3 崔玉芳,夏國偉,付小兵,楊紅,彭瑞云,谷慶陽,高亞兵,崔雪梅,胡文華,王小民,王德文;Bax和Bcl-2基因在單純和放射復合傷口中的表達及與細胞凋亡和愈合延遲的關(guān)系[J];中國危重病急救醫(yī)學;2002年07期

，

本文編號：2306590