【摘要】：第一部分HMGA2在鼻咽癌中的表達及臨床意義目的：比較HMGA2在鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎組織中的差異,分析HMGA2與臨床病理因素及預后的關系。方法：1.采用實時熒光定量PCR法檢測72例鼻咽癌及20例鼻咽慢性炎石蠟標本組織中HMGA2 mRNA表達,分析其與臨床病理因素的關系。2.采用免疫組化法檢測124例鼻咽癌及20例鼻咽慢性炎石蠟標本組織中HMGA2表達情況,并分析其與臨床病理因素的關系。3.采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,比較HMGA2 mRNA低表達組及高表達組3年無病生存率的差異。4.采用Log-rank檢驗比較124例患者免疫組化檢測HMGA2蛋白低表達組與高表達組3年總生存率的差異。風險比例模型(Cox回歸)分析影響預后的不良因素。結果：1.72例鼻咽癌組織中HMGA2 mRNA相對表達量(中位數0.294)高于鼻咽慢性炎組織(中位數0.045),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。HMGA2 mRNA在鼻咽癌組織中的表達與年齡、性別、分型、分期、復發(fā)參數無關(P0.05),與鼻咽癌患者的2年內轉移有關(P0.01)。2.124例鼻咽癌標本中59例HMGA2蛋白高表達(陽性率：47.58%),20例鼻咽慢性炎HMGA2均無表達(陽性率：0),鼻咽癌組織中HMGA2表達陽性率顯著高于慢性炎組織(x2=16.12,P0.01)。124例患者HMGA2蛋白在鼻咽癌中的表達與患者N分期、TNM分期、2年內復發(fā)、轉移因素有關(P0.01)。3.定量PCR結果顯示在生存率方面,HMGA2 mRNA高表達組的3年無病生存率相對較低(HR:3.52; 95% CI:1.34-7.79; P=0.01)。4.免疫組化顯示,全組鼻咽癌患者的3年生存率為78.8%(95%CI:0.708-0.852), HMGA2蛋白低表達組及高表達組3年生存率分別為90.8%(95%CI：0.806-0.957)及66.1%(95%CI：0.525-0.766),差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。單因素分析得出T分期、N分期,TNM分期及HMGA2高表達為不良預后因素。多因素分析得到N分期(HR：7.892,95%CI：2.731-22.807,P0.001)和HMGA2高表達((HR：2.683,95%CI：1.185-6.077,P=0.018))為影響鼻咽癌患者生存率的獨立的不良預后因素。結論：HMGA2與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有相關性,其有可能用于鼻咽癌的預后監(jiān)測及作為鼻咽癌治療的靶分子。第二部分HMGA2的表達對鼻咽癌細胞惡性生物學行為的影響目的：體外實驗初步明確HMGA2對鼻咽癌增殖、生長、侵襲、轉移等惡性生物學行為的影響。方法：1.采用實時熒光定量PCR法檢測及Western blot法檢測人永生化鼻咽上皮細胞NP-69細胞株,人鼻咽癌細胞株CNE-1, CNE-2,5-8F,6-10B, C666-1, HNE-1中HMGA2 mR NA及蛋白的表達情況。2.選取相對高表達HMGA2的兩株細胞CNE-1、CNE-2,瞬時轉染si-HMGA2, CCK-8及平板克隆形成實驗觀察細胞增殖,[ranswell小室法檢測細胞遷移、侵襲能力,流式細胞儀觀察細胞周期的變化。結果：1.鼻咽癌各細胞株中HMGA2 mRNA的表達均顯著高于NP69(P0.01)。同樣,HMGA2蛋白在鼻咽癌腫瘤細胞中也呈高表達,在正常鼻咽上皮細胞表達較低,結果有統(tǒng)計學差異(P0.01)。2.敲低HMGA2表達可以抑制鼻咽癌細胞的增殖能力,轉染si-HMGA2后,CNE-1和CNE-2細胞的生長速度在第2天、第3天、第4天均低于陰性對照組與空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。細胞遷移實驗表明,CNE-1與CNE-2兩株細胞的si-HMGA2組的細胞遷移的個數為41.22±4.45個及45.34±6.11個,對照組遷移的細胞數量為141.344±5.22及157.36±6.41,兩組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.001)。侵襲實驗顯示,CNE-1、CNE-2細胞中si-HMGA2組穿過Matrigel膠的細胞數分別為34.03±4.56,41.48±5.31,對照組細胞數分別為113.83±4.18及135.33±4.36,兩株細胞中兩組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.001)�？寺⌒纬蓪嶒烇@示,干擾HMGA2組與對照組相比CNE-1、CNE-2兩株細胞的克隆形成率分別降低了45%,55%(P0.001)。流式細胞儀結果顯示,si-HMGA2組與對照組相比,G1期細胞比例增高(P0.001), G2/M期細胞比例減少(P0.001)。結論：體外實驗證實了HMGA2可能參與了鼻咽癌的一系列惡性生物學行為,包括腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲、轉移等。第三部分HMGA2誘導E MT對鼻咽癌惡性生物學行為影響的機制目的：檢測并分析鼻咽癌HMGA2與上皮間質轉化標記物表達的相關性,初步探討HMGA2促進EMT可能的分子機制。方法：1.免疫組化法檢測124例鼻咽癌石蠟樣本中E-cadherin、Vimentin在癌組織中的表達。分析E-cadherin、Vimentin蛋白的表達與鼻咽癌臨床病理因素及預后關系。2. Spearman等級秩相關分析HMGA2、E-cadherin、Vimentin兩兩表達之間的相關關系。3. Western blot及細胞免疫熒光實驗觀察CNE-1、CNE-2細胞株中干擾HMGA2表達后E-cadherin、Vimentin、Snail在鼻咽癌細胞中的表達變化。4.干擾HMGA2的表達后,Western blot法觀察TGF-β/Smad通路中關鍵蛋白的變化。結果：1. HMGA2表達見第一部分,E-cadherin陽性顆粒主要定位于細胞膜,Vimentin陽性顆粒定位于細胞漿和／或部分細胞膜。E-cadherin在20例鼻咽慢性炎組織中15例高表達(陽性率：75%),在鼻咽癌組織中54例高表達(陽性率：43.55%),結果提示鼻咽癌組織中E-cadherin表達率低于慢性炎組織(x2=6.826,P0.001); Vimen tin在20例鼻咽慢性炎組織中均陰性表達(陽性率：0),鼻咽癌組織中78例高表達(陽性率：62.9%),提示鼻咽癌組織中Vimentin陽性表達率高于慢性炎組織(x2=27.449, P0.001)。2. E-cadherin在鼻咽癌中的表達與患者N分期、TNM分期、2年內復發(fā)及轉移有關(P0.01)。 Vimentin在鼻咽癌中的表達與患者N分期、TNM分期、2年內復發(fā)及轉移有關(P0.01)。在低表達E-cadherin組3年總生存率為70%(95%CI：0.578-0.792),而高表達E-cadherin組3年總生存率為88.8%(95%CI：0.768-0.948)；低表達Vimentin組3年總生存率為89.1%(95%CI：0.757-0.953),而高表達Vimentin組3年總生存率為71.8%(95%CI：0.604-0.804),差異均有統(tǒng)計學意義(P0.001)。3. E-cadherin與Vimentin表達呈負相關((r=-0.605,P0.001)。HMGA2的表達水平與Vimentin呈正相關(r=0.431,P0.001),HMGA2與E-cadherin表達水平呈負相關(r=-0.413,P0.001)。4. Western blot結果顯示在HMGA2高表達細胞株CNE-1、CNE-2中,E-cadherin表達較低,Vimentin表達較高,干擾HMGA2后,E-cadherin的表達均較對照組上調,Vimentin與Snail的表達均較對照組下調。細胞免疫熒光觀察CNE-2、CNE-1,干擾HMGA2組綠色熒光標記的E-cadherin(定位于胞膜)表達上調,紅色熒光標記Vimentin組(定位于胞漿或胞膜)表達下調。5.在細胞株CNE-1、CNE-2中,觀察TGFβRⅡ、Smad3、p-Smad3的表達情況,干擾HMGA2的表達后,發(fā)現TGFβ/Smad通路的關鍵蛋白TGFβRⅡ、 p-Smad3均顯著下調。結論：HMGA2的表達與EMT的上皮標志物E-cadherin表達呈負相關,與間質標志物Vimentin表達呈正相關。干擾HMGA2可導致E-cadherin上調、Vimentin下調,并可能通過TGF-β/Smad信號通路參與鼻咽癌EMT過程從而影響鼻咽癌增殖、轉移等惡性生物學行為。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63
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本文編號：2300271
