【摘要】：中耳膽脂瘤是一種在中耳和乳突腔內(nèi)的非腫瘤的疾病,其病理學(xué)特征包括鱗狀上皮角化功能受損、上皮增生的同時(shí)伴有異常的上皮內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化如微膽脂瘤的形成、基底膜的破壞、斷裂,膽脂瘤上皮下組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等。臨床表現(xiàn)主要有耳痛、流膿、聽力下降,嚴(yán)重的可波及面神經(jīng)引起面癱、波及半規(guī)管導(dǎo)致眩暈及顱內(nèi)外的感染危及生命,而這一切的原因都是膽脂瘤對(duì)臨近骨質(zhì)的破壞吸收所致。目前膽脂瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確。從分子生物學(xué)上研究發(fā)現(xiàn)多種因素,如增生、凋亡、分化、炎癥、感染、骨質(zhì)破壞、脂類代謝、血管發(fā)生在膽脂瘤的形成和臨床表現(xiàn)方面有著一定的作用,其中增生、分化和凋亡的異常表現(xiàn)是膽脂瘤上皮的最基本特征。研究多以與正常皮膚上皮的生物學(xué)特性相比較,發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮增殖的能力異常增高,這種高度的增殖同腫瘤細(xì)胞是類似的已達(dá)成共識(shí),目前分歧最大的地方是關(guān)于凋亡,包括凋亡能力、凋亡發(fā)生的途徑及凋亡的意義。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一種自主性死亡過程,由特定基因控制,在多種病理生理過程中是不可缺少的。一些學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤上皮細(xì)胞的凋亡能力增加,過度凋亡導(dǎo)致的膽脂瘤上皮脫落形成的角化物的聚集同膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),而且凋亡水平的變化同膽脂瘤的骨質(zhì)吸收與復(fù)發(fā)、殘留有關(guān),而另一些研究的結(jié)果則傾向于膽脂瘤上皮細(xì)胞中凋亡能力受到了阻滯,導(dǎo)致凋亡周期延長(zhǎng),細(xì)胞存在抗凋亡(anti-apoptosis)作用。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖、分化和死亡、遷移等多種生物學(xué)過程均受一類長(zhǎng)20-30nt的小RNA分子即Micro(mi)RNA的調(diào)控,mi RNA可以通過沉默其靶基因表達(dá)來發(fā)揮調(diào)控作用,其作用方式是與靶基因m RNA3’端非翻譯區(qū)里的特異的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。多項(xiàng)研究表明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后同mi RNA的作用密切相關(guān),同時(shí)mi RNA在多種異常增生性疾病和代謝性疾病中也發(fā)生了明顯的變化。Friedland等以耳后皮膚組織為對(duì)照,采用RT-PCR技術(shù)首次檢測(cè)到八種mi RNAs在膽脂瘤組織中的表達(dá)發(fā)生上調(diào),其中mi RNA-21的表達(dá)量改變最高,平均高于對(duì)照組4.4倍,其下游靶基因?yàn)镻TEN和PDCD。2011年陳曉華研究了膽脂瘤上皮增殖和凋亡的相互關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),凋亡相關(guān)mi RNA(apoptotic-associated mi RNA)let-7a在膽脂瘤上皮表達(dá)上調(diào)。Let-7 micro RNA家族是目前研究最廣泛的micro RNA之一,在調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡方面均有作用途徑參與。在大多數(shù)腫瘤呈現(xiàn)低表達(dá),提示let-7 micro RNA的功能抑制與腫瘤的凋亡能力下降密切相關(guān),而其在膽脂瘤中的高表達(dá)提示其對(duì)膽脂瘤細(xì)胞的調(diào)控模式顯然不同于在腫瘤細(xì)胞中的作用方式。2015年張文靜從Let-7a micro RNA對(duì)膽脂瘤細(xì)胞增生的影響進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)Let-7a micro RNA通過抑制mi RNA-21的作用而影響了細(xì)胞的增生,然而從mi RNA水平研究膽脂瘤凋亡以及l(fā)et-7 micro RNA參與中耳膽脂瘤凋亡的調(diào)控作用及具體途徑的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。相對(duì)于成人膽脂瘤來說,小兒膽脂瘤通常具有更強(qiáng)的攻擊性、侵襲性和復(fù)發(fā)性,既往研究表明凋亡的差異與膽脂瘤骨質(zhì)破壞、復(fù)發(fā)有關(guān),因而凋亡在上述兩種膽脂瘤中的表現(xiàn)有無差異以及mi RNA在其中起到的作用如何值得進(jìn)一步研究。本研究目的1.觀察兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤的凋亡能力的差異以及mi RNA-let-7c及其靶蛋白Bcl-xl在兩種膽脂瘤中的表達(dá)情況,研究mi RNA-let-7c與凋亡在膽脂瘤發(fā)生中的作用。2.以攜帶mi RNA-let-7c抑制體的慢病毒載體感染培養(yǎng)的膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞,觀察下調(diào)mi RNA-let-7c對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中mi RNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl表達(dá)情況以及對(duì)細(xì)胞凋亡能力的影響。3.觀察mi RNA-let-7c inhibitor干擾膽脂瘤細(xì)胞凋亡的具體途徑,以期闡明膽脂瘤中mi RNA-let-7c介導(dǎo)凋亡的發(fā)生機(jī)制,為我們認(rèn)識(shí)mi RNA在中耳膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供新的理論依據(jù)。第一部分mi RNA-let-7c在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤組織中的表達(dá)研究方法1.利用TUNEL法檢測(cè)29例兒童中耳膽脂瘤(年齡≤14歲)、29例成人中耳膽脂瘤(年齡≥18歲)的凋亡的差異,同時(shí)以相應(yīng)的兒童、成人耳后正常皮膚組織作為對(duì)照。2.提取29例成人膽脂瘤組織、29例兒童膽脂瘤組織和耳后皮膚組織中的m RNAs,其濃度和純度的檢測(cè)通過紫外分光光度儀獲得。3.利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兒童膽脂瘤、成人膽脂瘤組織和其對(duì)照組中mi RNA-let-7c的表達(dá)。4.采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)中耳膽脂瘤組織及對(duì)照組中Bcl-xl蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.膽脂瘤上皮的凋亡同耳后皮膚組織相比,凋亡顯著高于皮膚組(P0.05);成人中耳膽脂瘤上皮的凋亡能力高于兒童膽脂瘤(P0.05);兩組耳后正常皮膚組織間的凋亡無差異(P0.05)。2.成人膽脂瘤組織中mi RNA-let-7c的表達(dá)是對(duì)照組的11.96±0.09倍(P0.05);兒童膽脂瘤組織中mi RNA-let-7c的表達(dá)是對(duì)照組的7.94±0.04倍(P0.05);兒童和成人膽脂瘤間mi RNA-let-7c的表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);mi RNA-let-7c在兩組耳后皮膚上皮間的相對(duì)表達(dá)量無差異(P0.05)。3.Mi RNA-let-7c下游靶基因Bcl-xl在兩種膽脂瘤中均呈現(xiàn)低表達(dá),在成人膽脂瘤中的表達(dá)更低(P0.05)。第二部分下調(diào)mi RNA-let-7c對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中mi RNA-let-7c及其靶基因的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響方法1.采用兩步消化法獲取中耳膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞,在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)而利用角質(zhì)細(xì)胞角蛋白抗體行免疫熒光化學(xué)方法檢測(cè)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的性質(zhì)進(jìn)行鑒定。2.實(shí)驗(yàn)分組:mi R-let-7c-inhibitor組(實(shí)驗(yàn)組),mi R-let-7c-inhibitor NC組(陰性對(duì)照組),Mock組(空白對(duì)照組)。3.利用攜帶mi RNA-let-7c inhibitor的慢病毒載體和mi RNA-let-7c inhibitor NC的慢病毒載體感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞,同時(shí)以空白對(duì)照組作為對(duì)照,培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率,利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mi RNA-let-7c的表達(dá)是否下調(diào)。4.利用western blotting和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-let-7c inhibitor干擾對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中Bcl-xl蛋白和m RNA表達(dá)的影響。5.將感染mi RNA-let-7c inhibitor慢病毒后的膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板中,共培養(yǎng)10天,每天取3孔通過檢測(cè)OD值,繪制生長(zhǎng)曲線。6.如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96h后,三組細(xì)胞均進(jìn)行碘化丙啶染色30分鐘后,用FCM法測(cè)定細(xì)胞凋亡及周期的改變。7.如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96h后利用Annexin V-FITC染色法觀察細(xì)胞早期凋亡狀況,TUNEL原位酶標(biāo)記在熒光顯微鏡下觀察膽脂瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)果1.兩步消化法之后采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲得足夠數(shù)量的膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞,利用角蛋白抗體檢測(cè)提取獲得的膽脂瘤角質(zhì)上皮細(xì)胞的純度可達(dá)90%以上,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.Mi R-let-7c-inhibitor組的膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中mi RNA-let-7c的表達(dá)顯著低于mi R-let-7c-NC組和Mock組,mi RNA-let-7c在mi R-let-7c-NC組中的表達(dá)是mi R-let-7c-inhibitor組的10.19±0.26倍,在Mock組中的表達(dá)是mi R-let-7c-inhibitor組的10.92±0.31倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而在mi R-let-7c-NC組和Mock組中的表達(dá)無差異(P0.05)。3.Bcl-xl蛋白在膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞mi R-let-7c-inhibitor組的表達(dá)較mi R-let-7c-NC組和Mock組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在mi R-let-7c-NC組和Mock組中的表達(dá)無明顯差異(P0.05)。而Bcl-xl m RNA在mi R-let-7c-inhibitor組的表達(dá)同mi R-let-7c-NC組和Mock組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.Mi RNA-let-7c inhibitor干擾后膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度較兩對(duì)照組明顯增快,第5天mi R-let-7c-inhibitor組的OD值與mi R-let-7c-NC組和Mock組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),第9天時(shí)mi R-let-7c-inhibitor組因細(xì)胞密度過大,死亡細(xì)胞增多。5.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞96h后,凋亡細(xì)胞比例下降,同mi R-let-7c-NC組和Mock組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞周期分布出現(xiàn)明顯改變,S期細(xì)胞的數(shù)量增多(P0.05),G0/G1期細(xì)胞比例的下降(P0.05),即mi RNA-let-7c inhibitor促使膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期。6.Mi RNA-let-7c inhibitor感染后96h,Annexin V-FITC檢測(cè)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞的早期凋亡率明顯減少(P0.05);TUNEL法檢測(cè)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞凋亡比例也明顯減少(P0.05)。第三部分mi RNA-let-7c參與膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究方法1.利用western blotting檢測(cè)膽脂瘤組織及耳后皮膚組織中Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達(dá)。2.利用攜帶mi RNA-let-7c inhibitor的慢病毒載體感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組:mi R-let-7c-inhibitor組(實(shí)驗(yàn)組),mi R-let-7c-NC組(陰性對(duì)照組),Mock組(空白對(duì)照組)。3.如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞72小時(shí)后利用western blotting檢測(cè)mi R-let-7c inhibitor干擾對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、pro-caspase-3、pro-caspase-9和cytochrome C、Smac蛋白表達(dá)的影響。4.如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96小時(shí)后進(jìn)行JC-1染色,之后檢測(cè)三組細(xì)胞線粒體膜電位的差異。5.如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96小時(shí)后利用分光光度儀檢測(cè)caspase-3和caspase-9的活性。結(jié)果1.膽脂瘤組織同耳后皮膚組織相比,Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達(dá)均增加。2.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞72h后Bax、cytochrome C、Smac的表達(dá)明顯減少(P0.05),而pro-caspase-3、pro-caspase-9的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞96h后線粒體膜電位檢測(cè)中綠色熒光值明顯下降,表明線粒體膜電位上升(P0.05)。4.Mi RNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞96h后caspase-3和caspase-9的活性明顯降低(P0.05)。結(jié)論1.中耳膽脂瘤凋亡水平升高和mi RNA-let-7c的表達(dá)上調(diào),從mi RNA水平驗(yàn)證了膽脂瘤的高凋亡狀態(tài)的非腫瘤性質(zhì)。2.Mi RNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl和凋亡在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤中的表達(dá)有差異,這種差異提示兒童膽脂瘤的抗凋亡機(jī)制參與到了其發(fā)病機(jī)制中。3.Mi RNA-let-7c inhibitor慢病毒可有效沉默膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中mi RNA-let-7c的表達(dá),通過在翻譯水平的負(fù)性調(diào)控機(jī)制使其靶基因Bcl-xl蛋白的表達(dá)升高。4.Mi R-let-7c通過阻斷細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡,且以早中期細(xì)胞凋亡為主。5.Mi RNA-let-7c通過提高Bax/Bcl-xl比率,使線粒體膜電位降低,促進(jìn)Cyt c、Smac釋放入胞漿進(jìn)而激活一系列caspase蛋白酶通過線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R764.21

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本文編號(hào)：2234114