發(fā)布時間：2018-07-14 10:37

【摘要】：研究背景及目的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一,全球年發(fā)病率約為25/100,000,在世界范圍內(nèi)分布極不均勻,東南亞及我國南方沿海,如廣東、廣西、福建、香港等地高發(fā),且發(fā)病率在上述地區(qū)呈逐年增長的趨勢,嚴重威脅著我國人民的生命健康。大多數(shù)鼻咽癌為非角化型未分化癌,以高度增殖及轉移潛能為特征,對放射線較為敏感,放射治療是其首選的治療手段。對于早期鼻咽癌患者,隨著早診及精確放射治療技術的應用,5年生存率雖高達67%-80%,但仍有部分患者會發(fā)生局部復發(fā)和或遠處轉移；而對于初治就存在遠處轉移鼻咽癌患者,愈后更差。因此闡明鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展機制,探尋促進鼻咽癌增殖及轉移的相關因素,將有利于發(fā)現(xiàn)鼻咽癌診斷及預后分子標記和靶標、指導臨床個體化治療,進一步改善鼻咽癌患者的預后。鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展被認為與EB病毒感染、人種及地域等因素密切相關。近年研究表明：多種癌基因與抑癌功能基因的突變或異常表達促進鼻咽癌的惡性表型,在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色,因而成為研究的熱點。泛素蛋白酶系統(tǒng)在多種細胞生命活動中扮演著重要的角色,其主要由三種不同類型的酶及蛋白酶體組成,正常情況下,泛素活化酶E1在ATP存在的條件下促進泛素分子同泛素結合酶E2作用,在E3連接酶的作用下,介導泛素分子單泛素化或多泛素化相應的蛋白底物分子,導致相應底物分子的降解,或功能改變,而編碼上述酶系統(tǒng)的功能基因自身的異�；虮磉_異常被認為同多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關。泛素結合酶E2T (ubiquitin-conjugating enzyme E2T, UBE2T),屬于泛素結合酶E2家族成員,其具有一個大小約16～18 kDa特征性的保守結構域----泛素結合(UBC)結構域。其最先被認識是在范可尼貧血(Fanconi anemia)的相關研究中,UBE2T可作為范可尼信號通路(FA pathway)重要成員參與DNA損傷修復,正常情況下DNA的損傷首先激活范可尼通路,隨后泛素激活酶(E1酶)將泛素分子傳遞給泛素結合酶E2即UBE2T;接著UBE2T將泛素分子傳遞給該通路中的由8個主要成員組成的核心復合體(FANCA、FANCB、 FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL及FANCM);核心復合體再將泛素分子傳遞給FANCD2,導致FANCD2單泛素化,單泛素化的FANCD2向細胞核DNA損傷點聚集,促進DNA損傷分子的修復,進而維持基因組的完整性。而這一FA通路中的任一成員,包括UBE2T功能的失調(diào)均可能導致基因組穩(wěn)定性下降,誘發(fā)范可尼貧血或腫瘤易感傾向。Chantal H.M.A. Ramaekers的研究證實：在乏氧條件下,下調(diào)UBE2T的表達可增加化療藥物DNA損傷,增加化療敏感性,這進一步說明UBE2T在維持基因組完整性方面的重要作用。除維持基因組完整性方面的作用外,新近的研究表明UBE2T在肺癌、前列腺癌、乳腺癌中的表達明顯高于相應的癌旁組織,且UBE2T高表達水平同部分上述惡性腫瘤患者腫瘤大小、轉移等惡性特征及不良預后密切相關,這提示UBE2T可能具有促進惡性腫瘤增殖、侵襲及轉移的潛能。進一步的研究顯示UBE2T促進NIH3T3細胞株克隆形成；且UBE2T可介導BRCA1特異性的泛素化降解,促進乳腺癌細胞的增殖；Wen等的研究則闡明過表達UBE2T可通過作用于Vemintin,介導前列腺癌癌細胞的增殖、EMT及轉移。上研究均說明UBE2T在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用,但UBE2T與鼻咽癌患者臨床特征間的相關性,及對鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響尚未見報道。本研究試圖探討UBE2T與鼻咽癌患者惡性特征及預后間的相關性,及其對鼻咽癌細胞增殖、侵襲及轉移的影響和可能的分子機制,為將UBE2T作為鼻咽癌的分子診斷、預后判斷標記及分子靶向治療靶標提供理論依據(jù)。本研究擬采用免疫組化技術(IHC)檢測UBE2T在149例鼻咽癌樣本中的表達,分析UBE2T表達同鼻咽癌患者惡性特征及不良預后間的相關性,并進一步通過表達和(或)干擾UBE2T基因表達、western blot及免疫熒光(immunoflurescence, IF)等技術探討UBE2T對鼻咽癌細胞體內(nèi)外增殖及轉移的影響和可能的機制。方法1、UBE2T在鼻咽癌患者組織樣本中的表達利用免疫組織化學技術(Immunohistochemical staining, IHC)檢測149例鼻咽癌患者石蠟組織樣本中UBE2T的表達水平,并進行IRS (immunoreactive score, IRS)評分,明確UBE2T在鼻咽癌及相應癌旁組織中的表達水平；根據(jù)評分高低,采用Spearman相關分析評價UBE2T表達與鼻咽癌各臨床特征參數(shù)之間的相關性；并應用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗探討UBE2T表達水平對鼻咽癌患者預后的影響；運用單因素及多因素COX比例風險回歸模型評價各臨床特征參數(shù)及UBE2T表達水平對鼻咽癌患者預后的影響(單因素分析有意義者(P0.05)被納入多因素分析),明確UBE2T是否是鼻咽預后判斷的獨立風險因子。2、探討UBE2T體內(nèi)外促鼻咽癌細胞增殖及轉移效應2.1 UBE2T體內(nèi)、外促鼻咽癌增殖作用通過western blot檢測UBE2T在多株鼻咽癌細胞株中的表達,篩選出UBE2T相對低表達株C666-1及相對高表達株CNE2,進行相應的過表達及干擾試驗。用過表達慢病毒載體Lv-UBE2T或小干擾RNA siUBE2T轉染鼻咽癌細胞株,構建UBE2T過表達C666-1細胞株或UBE2T沉默的CNE2細胞株,采用western blot方法檢測轉染后UBE2T在各鼻咽癌細胞株中的表達水平,然后利用MTT法檢測慢病毒UBE2T過表達對鼻咽癌細胞株C666-1,及CCK8法檢測UBE2T siRNA干擾對鼻咽癌細胞株CNE2體外增殖的影響。通過平板克隆試驗檢測慢病毒UBE2T過表達對C666-1鼻咽癌細胞株體外克隆形成能力的影響。為檢測UBE2T過表達對鼻咽癌細胞體外增殖的影響,共轉染熒光素酶慢病毒及LV-UBE2T慢病毒構建熒光追蹤的UBE2T過表達C666-1鼻咽癌細胞株；為檢測UBE2T干擾對鼻咽癌細胞株CNE2體內(nèi)增殖的影響,UBE2T干擾慢病毒載體LV-sh UBE2T轉染構建UBE2T沉默的CNE2鼻咽癌細胞株。分別于BALB/c裸鼠雙側背部皮下注射UBE2T過表達及對照C666-1鼻咽癌細胞株,和UBE2T干擾及對照CNE2鼻咽癌細胞株構建裸鼠皮下瘤模型,采用活體成像技術、瘤體稱重和Ki-67免疫組化染色等技術檢測UBE2T過表達對C666-1鼻咽癌細胞株和UBE2T干擾對CNE2鼻咽癌細胞株體外增殖能力的影響。2.2 UBE2T體、內(nèi)外促鼻咽癌細胞遷移、侵襲及轉移作用在建立LV-UBE2T過表達或siUBE2T干擾的鼻咽癌細胞株的基礎上,通過劃痕試驗檢測UBE2T過表達對鼻咽癌細胞株C666-1體外遷移能力的影響,以及UBE2T干擾對鼻咽癌細胞株CNE2體外遷移能力的影響；通過基質膠Transwell檢測UBE2T過表達對C666-1鼻咽癌細胞株以及UBE2T干擾對CNE2鼻咽癌細胞株體外侵襲能力的影響。將LV-UBE2T及熒光素酶慢病毒共轉染的C666-1鼻咽癌細胞株BALB/c裸鼠鼠尾靜脈注射,通過活體成像、HE染色技術檢測UBE2T過表達對鼻咽癌細胞株C666-1體內(nèi)轉移能力的影響。3、UBE2T促進鼻咽癌細胞株增殖、侵襲及轉移的機制利用western blot技術檢測UBE2T慢病毒過表達對C666-1及siRNA干擾對CNE2鼻咽癌細胞株促增殖及轉移相關蛋白標記(Cyclin D1、C-JUN、C-MYC、 MMP2、MMP9)和AKT/GSK3β/β-catenin信號通路蛋白(p-AKT、P-GSK3β、 β-catenin)表達的影響；利用免疫熒光技術和核漿蛋白分離western blot技術檢測UBE2T對C666-1鼻咽癌細胞株β-catenin核漿轉位的影響。通過普通Transwell及基質膠ranswell檢測AKT特異性抑制劑(MK-2206 2HCl)對UBE2T促遷移、侵襲的阻斷作用；western blot技術檢測MK-2206 2HCl對UBE2T活化AKT/GSK3β/β-catenin信號通路效應的阻斷作用,及其對增殖、轉移相關標記蛋白表達的影響；并通過連續(xù)切片免疫組化技術檢側UBE2T、β-GSK3β在鼻咽癌樣本中的表達并分析其相關性。結果1、UBE2T的表達水平同鼻咽癌患者惡性特征及預后密切相關149例鼻咽癌患者石蠟切片免疫組化的結果顯示：UBE2T不同程度的表達于鼻咽癌細胞的細胞漿中,而在癌旁正常細胞中無或僅輕度表達于正常鼻咽粘膜的基底部(其中腫瘤組織中陽性表達為140/149,癌旁正常組織中位10/90,P0.001)。在典型的鼻咽癌癌巢中,癌巢周圍腫瘤細胞UBE2T的表達水平明顯高于癌巢中央。Spearman相關性分析則表明UBE2T的表達水平同鼻咽癌患者的T分期(P=0.006),M分期(P=0.038),及顱底侵犯(P=0.022)密切相關,Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗的結果表明UBE2T高表達鼻咽癌患者預后明顯差于低表達者(P=0.006)；單因素及多因素COX風險回歸分析表明：UBE2T表達水平(P=0.030)、N分期(P0.001)、M分期(P0.001)、顱底侵犯(P=0.043)是鼻咽癌患者預后不良的獨立危險因素。2、UBE2T促進鼻咽癌細胞株的體內(nèi)外增殖及轉移2.1 UBE2T促進鼻咽癌細胞株體內(nèi)外增殖western blot檢測示UBE2T在鼻咽癌細胞株C666-1中相對低表達,在鼻咽癌細胞株CNE2中相對高表達,因而在后續(xù)試驗中選擇C666-1細胞株行過表達試驗,選擇CNE2細胞株行干擾試驗。MTT及克隆形成試驗示：慢病毒載體UBE2T過表達促進C666-1鼻咽癌細胞株體外增殖(P0.001)及克隆形成(P0.001)。CCK8檢測示：siRNA干擾UBE2T抑制CNE2鼻咽癌細胞株體外增殖(P0.001)。慢病毒UBE2T過表達及對照C666-1鼻咽癌細胞株雙側鼠背部種植后,活體成像系統(tǒng)監(jiān)測熒光值示：UBE2T過表達鼻咽癌細胞株增殖速度明顯快于對照(P0.001)；于種植后11天處死裸鼠,UBE2T過表達組皮下瘤大小明顯大于對照,并明顯重于對照(P=0.024),且400×視野下皮下瘤中細胞增殖相關抗原ki-67陽性表達細胞數(shù)明顯多于對照(P0.001)。UBE2T干擾的CNE2鼻咽癌細胞株于種植后10天皮下瘤大小明顯小于對照,重量亦明顯輕于對照(P0.001)。2.2 UBE2T促進鼻咽癌細胞株體內(nèi)外侵襲、轉移能力劃痕試驗及基質膠Transwell檢測顯示：慢病毒UBE2T過表達促進C666-1鼻咽癌細胞株體外遷移及侵襲(P0.001),而siRNA干擾UBE2T抑制CNE2鼻咽癌細胞株體外遷移及侵襲(P0.001)。裸鼠體內(nèi)轉移研究則表明：UBE2T過表達促進熒光標記C666-1鼻咽癌細胞株體內(nèi)轉移(UBE2T過表達組log2總熒光吸收值對照組,P=0.034)；經(jīng)連續(xù)切片HE染色驗證的轉移器官數(shù)在UBE2T過表達組明顯多于對照組。3、UBE2T促進NPC細胞增殖、侵襲及轉移通過AKT/GSK3β/β-catenin信號通路介導western blot、免疫熒光及核漿分離western blot檢測示：UBE2T過表達增加C666-1鼻咽癌細胞株β-catenin表達及核轉位,促進其增殖、轉移相關靶蛋白(Cyclin D1、C-JUN、C-MYC、MMP2、 MMP9)和AKT/GSK3β/β-catenin信號通路上游蛋白p-AKT及p-GSK3p表達；而UBE2T干擾抑制β-catenin及其促增殖、轉移相關靶蛋白,抑制p-AKT及p-GSK3β表達。AKT特異性抑制劑(MK-22062HCl)可阻斷UBE2T過表達促C666-1遷移及侵襲效應(P0.001),同時MK-22062HCl抑制UBE2T對β-catenin及其促增殖、轉移相關靶蛋白(Cyclin D1、C-JUN、 C-MYC、MMP2、MMP9)的上調(diào)作用,并且能阻斷UBE2T對p-AKT及p-GSK3β上調(diào)。20例鼻咽癌樣本連續(xù)切片免疫組化結果示：UBE2T及P-GSK3p存在共表達且二者明顯相關(P=0.007)。結論1、鼻咽癌患者癌組織中UBE2T表達水平明顯高于癌旁正常組織；且UBE2T高表達同患者惡性特征及不良預后相關,是鼻咽癌預后不良的獨立危險因素,提示UBE2T可作為鼻咽癌診和預后判斷的分子標記。2、UBE2T促進鼻咽癌細胞株體內(nèi)外增殖、侵襲及轉移,提示UBE2T可作為鼻咽癌分子靶向治療的靶標。3、UBE2T通過激活Akt/GSK3β/β-catenin信號通路促進鼻咽癌細胞增殖、侵襲及轉移,闡明了UBE2T促鼻咽癌侵襲轉移的可能機制,并進一步提示UBE2T可作為鼻咽癌治療的分子靶標。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63

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1 胡威;泛素結合酶UBE2T在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制探討[D];南方醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：2121377