本文選題：糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR) + G蛋白偶聯(lián)受體91(GPR91)��； 參考：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病患者最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,目前發(fā)病機(jī)制尚未明確。通過模擬糖尿病的體內(nèi)外環(huán)境,觀察G蛋白偶聯(lián)受體91(GPR91)對DR微血管病理改變的影響;探討GPR91通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路調(diào)控VEGF的分子機(jī)制。方法:構(gòu)建GPR91小發(fā)夾RNA(sh RNA)慢病毒載體及相應(yīng)的空病毒。(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):健康雄性SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素制備糖尿病模型。成模2W時玻璃體腔注射GPR91 sh RNA慢病毒。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測視網(wǎng)膜中琥珀酸含量。注射病毒后12W,HE染色,透射電鏡和依文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)觀察視網(wǎng)膜微血管的結(jié)構(gòu)及功能改變。(2)體外實(shí)驗(yàn):高糖/琥珀酸/低氧孵育的RGC-5細(xì)胞和原代視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染GPR91 sh RNA或si RNA,Western blot檢測GPR91,p-ERK1/2,p-JNK,p-p38 MAPK,COX-2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF的表達(dá)情況;免疫熒光檢測GPR91,C/EBPβ,C/EBPδ和c-Fos的胞內(nèi)定位情況;RT-PCR檢測GPR91,COX-2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF的m RNA表達(dá);ELISA檢測PGE2和VEGF的分泌情況;RGC-5與RF/6A細(xì)胞共培養(yǎng)檢測RF/6A細(xì)胞的增殖遷移能力;熒光素酶報告系統(tǒng)(Luciferase)和染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)檢測C/EBP、AP1調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果:成功構(gòu)建GPR91 shRNA慢病毒載體。(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中琥珀酸含量較對照組增加(P0.01),GPR91的表達(dá)并未出現(xiàn)明顯差異。GPR91sh RNA玻璃體腔注射可改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管結(jié)構(gòu)和功能的破壞。(2)體外實(shí)驗(yàn):RGC-5細(xì)胞和原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞經(jīng)高糖/琥珀酸/低氧孵育,p-MAPK,COX-2,PGE2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF表達(dá)均增加(P0.01)。轉(zhuǎn)染GPR91 sh RNA或si RNA后p-ERK,p-JNK,COX-2,PGE2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF表達(dá)下調(diào)。ERK1/2抑制劑預(yù)處理后COX-2,PGE2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF表達(dá)下調(diào)。COX-2抑制劑預(yù)處理后PGE2和VEGF表達(dá)下調(diào);轉(zhuǎn)染GPR91 sh RNA后抑制共培養(yǎng)的RF/6A細(xì)胞增殖遷移能力(P0.01)。C/EBPβsi RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后VEGF表達(dá)下調(diào);Luciferase和Ch IP結(jié)果顯示C/EBPβ調(diào)節(jié)VEGF的轉(zhuǎn)錄過程。結(jié)論:早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中琥珀酸蓄積;玻璃體腔注射GPR91 sh RNA可改善視網(wǎng)膜微血管病變。GPR91通過ERK1/2/COX-2/PGE2通路調(diào)控VEGF的分泌進(jìn)而調(diào)控高糖/琥珀酸孵育下內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力;GPR91可通過ERK1/2/CEB/Pβ通路調(diào)控缺氧條件下原代神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的VEGF轉(zhuǎn)錄。
[Abstract]:Objective: diabetic retinopathy (DRN) is one of the most serious microvascular complications in diabetic patients. The effects of GPR91 on the pathological changes of Dr microvessels were observed by simulating the in vivo and in vivo environment of diabetes mellitus, and the molecular mechanism of GPR91 regulating VEGF through mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway was investigated. Methods: to construct GPR91 small hairpin RNA-RNA lentivirus vector and the corresponding empty virus. In vivo experiment: healthy male Sprague-Dawley rats were injected intraperitoneally with streptozotocin to make diabetic model. GPR91 sh RNA lentivirus was injected into vitreous cavity at 2 W. The content of succinic acid in retina was determined by gas chromatography-mass spectrometry. After the injection of the virus, he stained with 12W, Transmission electron microscopy and Evans blue leakage assay to observe the changes of structure and function of retinal microvessels in vitro: high glucose / succinic acid / hypoxia incubated RGC-5 cells and primary retinal ganglion cells transfected with GPR91 sh RNA or si RNAs Western blot The expression of c-Fos and VEGF in the C / EBP 尾 -C / EBP 未 -C / EBP 未 -c-Fos and VEGF were detected. The intracellular localization of C- / EBP 尾 -C / EBP 未 and c-Fos were detected by immunofluorescence. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of C / EBP 尾 -C / EBP 未 -c-Fos and VEGF. The secretion of PGE2 and VEGF was detected by Elisa. The proliferation and migration of RF6A cells were detected by co-culture of RGC-5 and RF-6A cells. Luciferase reporting system (Luciferase) and chromatin immunoprecipitation (Ch IP) were used to detect the transcription of VEGF regulated by C / EBP PnAP1. Results: the successful construction of GPR91 shRNA lentivirus vector in vivo: the content of succinic acid in the retina of diabetic rats was increased compared with the control group. There was no significant difference in the expression of GPR91. GPR91sh RNA intravitreal injection could improve the visual reticulum of diabetic rats. The damage of membrane microvessel structure and function. (2) in vitro, the expression of c-Fos and VEGF were increased in 10% RGC-5 cells and primary ganglion cells incubated with high glucose / succinic acid / hypooxic acid / PGE2PGE2C / EBP 尾 -C / EBP 未 -c-Fos and VEGF. After transfection of GPR91 sh RNA or si RNA, the expression of PGE2, c-Fos and VEGF were down-regulated after transfection of GPR91 sh RNA or si RNA, and the expression of PGE2 and VEGF were down-regulated after pretreatment with COX-2 inhibitor. The expression of PGE2 and VEGF were down-regulated after pretreatment with COX-2 inhibitor. After transfection of GPR91 sh RNA, the proliferation and migration ability of co-cultured RFR / 6A cells was inhibited and the expression of VEGF was down-regulated after transfection of C- / EBP 尾 -si RNA. The results showed that C / EBP 尾 regulated the transcription process of VEGF. Conclusion: succinic acid accumulates in retina of early diabetic rats. Injection of GPR91 sh RNA into vitreous body can improve retinal microangiopathy. GPR91 regulates the secretion of VEGF through ERK1 / 2 / COX-2 / PGE2 pathway, and then regulates the angiogenesis of endothelial cells incubated with high glucose / succinic acid. GPR91 can regulate the angiogenesis of endothelial cells under hypoxia through ERK1 / 2 / CEB- P 尾 pathway. VEGF transcription in primary ganglion cells.
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R774.1

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本文編號：1982393