本文選題：小耳畸形 + 生物信息學(xué)分析　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：目的：通過對先天性小耳畸形患者的殘耳軟骨與對側(cè)正常耳廓軟骨組織進(jìn)行基因芯片的檢測,篩選出小耳畸形相關(guān)差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs,根據(jù)生物信息學(xué)分析KEGG通路、GO分析等方法對差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行功能注釋和分析。進(jìn)一步篩選出可能與小耳畸形相關(guān)的LncRNAs和mRNAs,并通過qRT-PCR和Western blotting的方法進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證,為今后深入研究先天性小耳畸形的分子機(jī)制及其防治提供科學(xué)依據(jù)。方法：樣本均源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院收治的單側(cè)非綜合征型先天性小耳畸形患者�；级罢６M織均無感染及軟骨炎等征象。樣本均來源于耳再造三期手術(shù)中的廢棄組織,每側(cè)各約100mg,其中正常側(cè)耳廓軟骨組織取自術(shù)中為矯正雙側(cè)顱耳角不對稱所廢棄的部分。本實(shí)驗(yàn)以殘耳軟骨組織為實(shí)驗(yàn)組,正常耳軟骨組織為對照組。通過Array star Human LncRNA Microarray V3.0篩選單側(cè)先天性小耳畸形患者差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs.通過KEGG生物學(xué)通路分析、GO分析等對差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs進(jìn)行功能注釋和預(yù)測,并采用CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖對重點(diǎn)的LncRNAs進(jìn)行編碼-非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。根據(jù)生物信息學(xué)分析選擇LncRNA-NR_028308、 LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及其鄰近編碼蛋白基因Zinc Finger Protein 36-Like 2 (ZFP36L2)兩組基因,通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blotting的方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)情況。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)所用的基因芯片包含30586個(gè)lncRNAs和26109個(gè)mRNAs探針；與正常側(cè)軟骨比較,殘耳軟骨共檢測出差異性表達(dá)LncRNAs共有180條,其中表達(dá)上調(diào)的LncRNAs有74條,表達(dá)下調(diào)的LncRNAs有106條。差異表達(dá)的mRNAs共有515條,其中表達(dá)上調(diào)的mRNAs有101條,表達(dá)下調(diào)的mRNAs有414條。信號通路分析顯示上調(diào)通路有5條,下調(diào)通路有27條,涉及到甘油酯類代謝、破骨細(xì)胞分化、腫瘤生長等通路。在GO分析中,我們的結(jié)果中上調(diào)基因中涉及生物過程的基因有321條,涉及細(xì)胞組件的基因有16條,以及分子功能的基因有41條。下調(diào)基因中涉及生物過程的基因共有553條,涉及細(xì)胞組件的基因有101條,以及分子功能的基因有74條。同時(shí)選擇了15個(gè)LncRNAs和120個(gè)mRNAs構(gòu)建了CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。我們對所選擇的LncRNA-NR_028308、 LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及ZFP36L2兩組基因,通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blotting的方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)情況。與對照組驗(yàn)證結(jié)果顯示,qRT-PCR方法驗(yàn)證的兩組LncRNAs和mRNAs基因表達(dá)均上調(diào),P值小于0.05,與芯片結(jié)果一致。用Western blotting法檢測差異表達(dá)基因蛋白水平的表達(dá),結(jié)果顯示與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組軟骨組織中與對照組相比LPL、TNFRSF11B和ZFP36L2基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：先天性小耳畸形在相同遺傳背景下殘耳軟骨與正常耳廓軟骨組織之間lncRNAs和mRNAs的表達(dá)存在明顯的差異,這些lncRNAs及mRNAs可能通過某些信號通路在小耳畸形發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。LncRNA-NR_028308、 LncRNA-uc003jsd.1及LPL、 TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及ZFP36L2在先天性小耳畸形中參與的生物過程、信號通路等可能與先天性小耳畸形的發(fā)病有關(guān)。
[Abstract]:Objective: to screen the differentially expressed LncRNAs and mRNAs of the small ear malformation by detecting the gene chip of the residual ear cartilage and the contralateral normal auricle cartilage tissue in the patients with congenital microtia. The functional annotation and analysis of the differentially expressed mRNAs were carried out according to the bioinformatics analysis of KEGG pathway and GO analysis. LncRNAs and mRNAs, which may be associated with the microtia, were selected and verified by qRT-PCR and Western blotting, and the scientific basis for the further study of the molecular mechanism and prevention of congenital microtia was provided. There were no signs of infection and cartilage inflammation in the patients with congenital microtia. All the samples were derived from the discarded tissues in the three stages of the reconstruction of the ear. Each side was about 100mg. The normal lateral auricular cartilage tissue was taken from the operation to correct the discarded parts of the bilateral cranial angle. The experiment was conducted with the cartilage tissue of the residual ear. Group, normal ear cartilage tissue was the control group. Through Array star Human LncRNA Microarray V3.0 screening the differential expression of unilateral congenital microtia patients, LncRNAs and mRNAs. were analyzed by KEGG biological pathway, GO analysis and other expressions of LncRNAs and mRNAs were annotated and predicted. Dot LncRNAs carries out the construction of coencoded non coding gene co expression network. According to bioinformatics analysis, LncRNA-NR_028308, LncRNA-uc003jsd.1 and LPL, TNFRSF11B and LncRNA-ENST00000449766 and the adjacent coding protein gene Zinc Finger Protein 36-Like 2 (ZFP36L2) two genes are selected by real time quantitative polymerase chain reaction and Wes. Tern blotting method further verified its expression. Results: the gene chip used in this experiment contains 30586 lncRNAs and 26109 mRNAs probes. Compared with the normal lateral cartilage, there are 180 items of LncRNAs in the residual ear cartilage, of which there are 74 up-regulated LncRNAs and 106 down regulated LncRNAs. There were 515 expressions of mRNAs, of which 101 were up-regulated and 414 down regulated mRNAs. Signal pathway analysis showed that there were 5 up-regulated pathways and 27 down regulated pathways involved in the pathway of glycerol ester metabolism, osteoclast differentiation, tumor growth and so on. In GO analysis, our results up-regulated the basis for biological processes involved in the gene. There were 321 genes involved in cell components, 16 genes and 41 molecular functions. There were 553 genes involved in the biological processes, 101 genes involved in cell components, and 74 molecular functions, and 15 LncRNAs and 120 mRNAs were selected to construct a CNC co expression network. Two genes of LncRNA-NR_028308, LncRNA-uc003jsd.1 and LPL, TNFRSF11B and LncRNA-ENST00000449766 and ZFP36L2 were further verified by real-time quantitative polymerase chain reaction and Western blotting. The results showed that the expression of the two groups of LncRNAs and mRNAs genes in the qRT-PCR method proved up up. The Western blotting method was used to detect the expression of differentially expressed gene protein levels by Western blotting. The results showed that compared with the control group, the experimental group was up to LPL, TNFRSF11B and ZFP36L2 gene expression in the cartilage tissue compared with the control group. Conclusion: the congenital auricular malformation in the same genetic background and normal ear under the same genetic background. There are obvious differences in the expression of lncRNAs and mRNAs among the cartilage tissue. These lncRNAs and mRNAs may play an important role in the occurrence and development of small ear deformities through some signaling pathways,.LncRNA-NR_028308, LncRNA-uc003jsd.1 and LPL, TNFRSF11B and LncRNA-ENST00000449766 and ZFP36L2 in congenital microtia. Process and signal pathway may be related to the pathogenesis of congenital microtia.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R764.7

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本文編號：1923677