本文選題：鼻咽癌 + STGC3基因　； 參考：《南華大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：[目的]運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測STGC3基因啟動子,克隆并鑒定STGC3啟動子;在此基礎(chǔ)上,預(yù)測STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,分析并證實(shí)STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件;進(jìn)一步探討STGC3基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對STGC3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。定點(diǎn)突變STGC3基因結(jié)構(gòu)位點(diǎn),通過檢測基因突變后對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,探討STGC3基因發(fā)揮抑瘤作用的功能性位點(diǎn),本研究為闡明STGC3基因的結(jié)構(gòu)、功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]采用生物信息學(xué)預(yù)測并分析STGC3基因啟動子區(qū),克隆最有可能的啟動子,構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,質(zhì)粒經(jīng)酶和測序鑒定,經(jīng)脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)至細(xì)胞,通過報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物雙熒光素酶活性檢測,以鑒定STGC3基因啟動子區(qū)。在啟動子鑒定基礎(chǔ)上,預(yù)測STGC3基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合位點(diǎn),采用電泳遷移率變動分析法(EMSA)及染色質(zhì)免疫共沉淀分析(Ch IP)法,驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合位點(diǎn),從而明確該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。采用RT-PCR和Western blot檢測STGC3基因高表達(dá)的NP69細(xì)胞系和STGC3基因低表達(dá)的CNE2細(xì)胞系中Sp1的表達(dá)水平,然后運(yùn)用RNAi技術(shù)干擾細(xì)胞中Sp1的表達(dá),通過q RT-PCR和Western blot,分析Sp1低表達(dá)后對STGC3基因的影響,以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子Sp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。針對STGC3基因糖基化位點(diǎn)(656 C)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(725 C)和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(913 T),3個(gè)可能性功能位點(diǎn),運(yùn)用Stratagene定點(diǎn)突變技術(shù),對STGC3蛋白糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)分別進(jìn)行單堿基定點(diǎn)突變,使656 C突變?yōu)镚,725 C突變?yōu)門,913 T突變?yōu)镚。構(gòu)建帶His標(biāo)簽的突變重組真核表達(dá)質(zhì)粒,質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、抽提、酶切及測序鑒定,轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞系。通過RT-PCR和Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)從m RNA和蛋白質(zhì)水平檢測,得到穩(wěn)定表達(dá)突變STGC3基因的CNE2細(xì)胞系。通過MTT和胎盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測STGC3基因突變對CNE2細(xì)胞生長增殖影響,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測STGC3基因突變對CNE2細(xì)胞周期以及凋亡影響,采用Western blot對凋亡相關(guān)蛋白Bax的影響,以明確STGC3基因的抑瘤功能位點(diǎn)。[結(jié)果]生物信息學(xué)結(jié)果顯示,STGC3基因5’端上游的-3046bp至-46bp區(qū)域有啟動子活性,在-2992bp至-69bp間啟動子分值達(dá)0.8以上,其中-845bp至-795bp間分值最高,達(dá)到1.0。在-1140bp和-774bp處檢測到GC盒信號,在-441bp處檢測到CAAT盒信號。有兩個(gè)Cp G島:分別在-1805bp至-1705bp和-900bp至-684bp間;有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn):分別在-2348bp和-948bp處。經(jīng)不同長度的片段缺失比對,取最有可能的283bp(-1360bp至-1077bp)、281 bp(-934bp至-653bp)和571 bp(-500bp至+72bp)啟動子片段,構(gòu)建p GL3-en283、p GL3-en281、p GL3-en571三種質(zhì)粒,與陰性對照p GL3-enhance質(zhì)粒相比,三種質(zhì)粒均具有較強(qiáng)的啟動子活性,三種質(zhì)粒中以p GL3-en281質(zhì)粒的啟動子活性最強(qiáng)。認(rèn)為-934bp至-653bp為STGC3基因核心啟動子區(qū)。生物信息學(xué)結(jié)果顯示,在STGC3基因核心啟動子區(qū)-934bp至-653bp區(qū)域存在21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其中9個(gè)為Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);當(dāng)嚴(yán)格限定參數(shù)后,結(jié)果顯示,基因核心啟動子區(qū)域含有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其中Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)2個(gè)。經(jīng)EMSA和Ch IP實(shí)驗(yàn)證實(shí),結(jié)果顯示,STGC3基因中存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1特異性結(jié)合位點(diǎn),從而鑒定出STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞組(1.12±0.05)中,轉(zhuǎn)錄因子Sp1在m RNA水平上,表達(dá)較NP69細(xì)胞組(0.33±0.02)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Western blot結(jié)果顯示,CNE2細(xì)胞組(2.67±0.28)中轉(zhuǎn)錄因子Sp1在蛋白水平上,表達(dá)高于NP69細(xì)胞組(1.17±0.17),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明轉(zhuǎn)錄因子Sp1有可能負(fù)調(diào)控STGC3基因。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建3個(gè)Sp1-sh RNA干擾質(zhì)粒,經(jīng)酶切及測序鑒定,結(jié)果顯示,片段大小一致,序列正確,表明成功構(gòu)建了Sp1干擾載體。Sp1-sh RNA干擾載體,經(jīng)q RT-PCR及western blot篩選。篩選出干擾效率高的Sp1-sh RNA載體,轉(zhuǎn)染至Sp1高表達(dá)的CNE2細(xì)胞系,q RT-PCR及western blot檢測STGC3基因表達(dá),結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞系中,干擾Sp1表達(dá)后,STGC3表達(dá)增高。突變質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定,酶切結(jié)果顯示目的片段大小一致,測序結(jié)果顯示序列正確,成功構(gòu)建三個(gè)突變型(His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T和His-STGC3-T913G)真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞系,突變質(zhì)粒經(jīng)RT-PCR、Western Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,突變質(zhì)粒均表達(dá)STGC3基因m RNA和His-tag-STGC3融合蛋白質(zhì),MTT和胎盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)生長曲線結(jié)果表明,His-STGC3-C656G和His-STGC3-C725T突變組對細(xì)胞的生長增殖抑制能力降低,與野生型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);His-STGC3-T913G突變組不影響細(xì)胞生長增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,His-STGC3-C656G組(1.20%±0.13%)和His-STGC3-C725T組(1.50%±0.26%),細(xì)胞凋亡率降低,與His-STGC3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),三個(gè)突變組對細(xì)胞生長周期無影響。Western Blot對凋亡相關(guān)蛋白Bax檢測,結(jié)果顯示,His-STGC3-C656G和His-STGC3-C725T突變組Bax蛋白表達(dá)降低,與野生型His-STGC3組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。[結(jié)論](1)-2992bp至-69bp為STGC3基因的啟動子區(qū),-934b至-653bp為其核心啟動子區(qū);(2)STGC3基因啟動子區(qū)內(nèi)有Sp1特異性結(jié)合位點(diǎn),Sp1對STGC3基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用;(3)STGC3基因656位C和725位C,是其重要功能性位點(diǎn)。
[Abstract]:Objective : To use bioinformatics to predict the STGC3 gene promoter , clone and identify the STGC3 promoter . On the basis of this , the STGC3 gene transcription regulatory element was predicted , and the transcription regulation of STGC3 gene was confirmed . The effect of STGC3 gene related transcription factors on the transcriptional regulation of STGC3 gene was further discussed . The transcription factors specific binding sites of STGC3 gene were determined by reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western blot . The results showed that the promoter activity of transcription factor Sp1 was higher than that of the negative control p GL3 - en281 . The results showed that the transcription factor Sp1 was higher than that of NP69 cell group ( 1.17 鹵 0.17 ) . The results showed that the transcription factor Sp1 was higher than that of NP69 cell group ( 1.17 鹵 0.17 ) . The expression of STGC3 - C656G , His - STGC3 - C725T and His - STGC3 - T913G were detected by RT - PCR , Western Blot and Western blot . The results showed that there were significant differences in the expression of STGC3 - C656G , His - STGC3 - C725T and His - STGC3 - T913G .

【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1875956