本文選題：嵌合抗原受體 + c-Met　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景鼻咽癌(NPC)是我國高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一,主要發(fā)病于我國的南方地區(qū)。但是由于其解剖位置較深和早期癥狀不典型,約80%的鼻咽癌患者在第一次就診時(shí)就已經(jīng)發(fā)展到晚期。放療聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療為局部晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,雖然局部和區(qū)域控制率有所改善,超過30%的患者仍然發(fā)生復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。面臨這些挑戰(zhàn),迫切需要發(fā)展新的治療策略,以提高局部晚期鼻咽癌患者的生存率。最新研究結(jié)果表明,鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與原癌基因編碼的產(chǎn)物c-Met密切相關(guān)。c-Met蛋白屬于肝細(xì)胞生長因子受體家族,c-Met通過與配體肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)結(jié)合,激活HGF/c-Met信號(hào)通路,降低細(xì)胞間的粘附力,有利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此,c-Met可以成為鼻咽癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)T細(xì)胞是一種將抗體靶向治療和T細(xì)胞免疫治療相結(jié)合的治療方法。通過識(shí)別腫瘤表面抗原,帶領(lǐng)T細(xì)胞到達(dá)腫瘤周圍,發(fā)揮T細(xì)胞的免疫功能,實(shí)現(xiàn)識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。是一種很有發(fā)展空間的治療腫瘤的策略。本研究擬在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)制備好的抗c-Met Fab抗體的基礎(chǔ)上,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建靶向c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞,制備c-Met CAR-T,觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,為鼻咽癌治療提供新發(fā)法、新思路。研究目的1.構(gòu)建靶向c-Met的嵌合抗原受體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。2.制備抗c-Met CAR-T;觀察c-Met CAR-T對(duì)于c-Met陽性鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用;檢測c-Met CAR-T與c-Met陽性的鼻咽癌共培養(yǎng)后細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 的變化。研究方法1.利用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗c-Met scFv,并將其重組到含有人IgG分子的CH2CH3以及CD28,CD137,CD3ζ等的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,形成c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,經(jīng)過測序檢測確認(rèn)。2.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染293T細(xì)胞,通過Western blotting檢測c-Met CAR在293T細(xì)胞中的表達(dá)。3.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝后感染T淋巴細(xì)胞,通過Western blotting檢測c-Met CAR在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。4.通過流式、RT-PCR、Western Blotting方法篩選出表達(dá)c-Met的鼻咽癌細(xì)胞株,以及不表達(dá)c-Met的腫瘤細(xì)胞株。5.通過CCK-8法檢測c-Met CAR-T細(xì)胞和對(duì)照組CD19 CAR-T、未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞與鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、HONE1共培養(yǎng)4h、12h、24h后,對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株的增殖抑制作用。6.c-Met CAR-T與鼻咽癌細(xì)胞共培養(yǎng)24h后,通過ELISA法檢測細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 的變化。研究結(jié)果1.經(jīng)PCR擴(kuò)增、優(yōu)化、酶切,連接等方法構(gòu)建c-Met CAR逆病毒載體,經(jīng)測序檢測序列正確。2.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染293T細(xì)胞,裂解蛋白,Western Blotting檢測到抗人CD3ζ抗體的表達(dá),與預(yù)期大小一致。結(jié)果說明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在293T細(xì)胞中表達(dá),293T細(xì)胞能夠用于病毒包裝。3.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T淋巴細(xì)胞,裂解蛋白,Western Blotting檢測到抗人內(nèi)源性、外源性人CD3ζ抗體的表達(dá)分別為22KD、76KD,與預(yù)期大小一致。結(jié)果說明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在T淋巴細(xì)胞中表達(dá),成功制備 c-Met CAR-T。4.通過流式、RT-PCR、Western Blotting成功篩選出表達(dá)c-Met的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和HONE1,以及不表達(dá)c-Met的對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞株HO8910。5.CCK-8結(jié)果顯示c-Met CAR-T與鼻咽癌細(xì)胞分別共培養(yǎng)4h、12h、24h,4 h時(shí)殺傷率最高。隨著T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞比例的增加,對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制作用就越明顯。當(dāng)比例為20:1時(shí),殺傷率最高,c-MetCAR-T細(xì)胞對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株 CNE2、HONE1 的殺傷率分別為 60.33 ± 3.73%、61.33 ± 4.73%。而對(duì)于對(duì)照組CD19CAR-T組和未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞組(UTD)對(duì)HONE1、CNE2的殺傷率僅僅分別為 27.67 ±0.94%、26.67± 0.47%,30.67 ±1.70%、28.13 ±0.50%。相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.ELISA結(jié)果顯示c-MetCAR-T與c-Met陽性的鼻咽癌細(xì)胞株共培養(yǎng)后分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2明顯增加;而與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2只有微量。兩組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論1.本研究成功制備了靶向c-Met的嵌合抗原受體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。該嵌合抗原受體能在T細(xì)胞中表達(dá),成功制備c-MetCAR-T。2.c-Met CAR-T有效抑制c-Met陽性鼻咽癌細(xì)胞增殖,增加IFN-γ、IL-2的分泌。
[Abstract]:This paper studies the effect of c - Met CAR - T on the biological characteristics of nasopharyngeal carcinoma cells . The results show that c - Met protein belongs to the family of hepatocyte growth factor receptor , and c - Met is a promising target for the treatment of nasopharyngeal carcinoma . The expression of c - Met CAR - T cells was detected by Western blotting . The expression of c - Met CAR - T cells was detected by Western blotting . The cytotoxicity of c - MetCAR - T cells to CNE2 and HONE1 was 60.33 鹵 3.73 % , 61.33 鹵 4.73 % respectively .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1778738