本文選題：組織工程角膜　切入點(diǎn)：人角膜基質(zhì)細(xì)胞　出處：《中國海洋大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：角膜(Cornea)是位于眼球表面的一層透明組織,是維持正常視功能的重要結(jié)構(gòu),由于位于眼表的最外層,因而極易受到損傷和感染,致使角膜病是引起視力下降甚至致盲的主要因素,目前主要依賴于角膜移植手術(shù)進(jìn)行治療。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國現(xiàn)有角膜病盲患者300余萬,均需要通過角膜移植進(jìn)行治療,但因捐獻(xiàn)角膜數(shù)量有限和供體角膜老化,每年能接受手術(shù)治療的患者只有1000余人,絕大多數(shù)患者因得不到可用的供體角膜而無法接受角膜移植和復(fù)明。目前,體外構(gòu)建的組織工程角膜(Tissue-engineered human cornea)作為捐獻(xiàn)角膜的替代物,是解決供體角膜匱乏的主要途徑,已成為眾多角膜病盲患者重見光明的希望。組織工程角膜體外構(gòu)建的核心要素是種子細(xì)胞(Seeder cells)、載體支架(Carrier scaffold)和信號(hào)分子(Signaling molecules)。組織工程角膜的體外構(gòu)建,要求種子細(xì)胞必須能夠持續(xù)保持細(xì)胞固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、旺盛的增殖能力、穩(wěn)定的遺傳性能和發(fā)揮固有功能的潛能,要求載體支架必須具有與天然角膜類似的光學(xué)性能、三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)、生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度。獲得足量正常的種子細(xì)胞和生物相容性理想的的載體支架是開展組織工程角膜體外構(gòu)建研究的前提條件。人角膜在組織結(jié)構(gòu)上由上皮層(Epithelium)、前彈力層(Bowman's membrane)、基質(zhì)層(Stroma)、后彈力層(Descemet' membrane)和內(nèi)皮層(Endothelium)構(gòu)成。其中,人角膜基質(zhì)(Human cornea stroma, HCS)由交錯(cuò)排列的200-250個(gè)膠原板層結(jié)構(gòu)和散在分布的HCS細(xì)胞組成,占角膜厚度的90%,在角膜厚度和透明度維持中具有關(guān)鍵作用；而人角膜內(nèi)皮(Human cornea endothelium, HCE)位于角膜最內(nèi)層、由連接緊密的單層HCE細(xì)胞鑲嵌而成,是角膜和前房的天然屏障,通過泵-漏機(jī)制維持角膜透明度并為角膜供養(yǎng)/氧,在角膜厚度和透明度維持中具有決定性作用。在角膜受到深度創(chuàng)傷和感染時(shí),往往會(huì)傷及深層HCS和HCE,即后板層半角膜,輕者引起角膜水腫和角膜內(nèi)皮失代償,重者甚至致盲。目前后板層半角膜的治療方法主要是通過單層HCS和HCE的多次角膜移植手術(shù),不僅增加了手術(shù)創(chuàng)傷和感染的風(fēng)險(xiǎn),而且在角膜愈合和移植瘢痕殘留方面也存在有諸多缺陷。因此,體外構(gòu)建出可用于移植的組織工程人后板層半角膜(Tissue-engineered posterior hemicornea, TE-pHC)已成為學(xué)者們新的研究熱點(diǎn)。本文研究目的就是利用本實(shí)驗(yàn)室自主建立的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的HCE細(xì)胞系和HCS細(xì)胞系作為種子細(xì)胞,以帶后彈力層的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine corneal stromata with Descemet' membrane, aPCS-DM)為載體支架,進(jìn)行TE-pHC的體外構(gòu)建研究,旨在獲得與活體角膜后半層組織結(jié)構(gòu)高度近似的TE-pHC。為了獲得足量正常的TE-pHC種子細(xì)胞,本文首先對(duì)非轉(zhuǎn)染無致瘤性HCS和HCE組織細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行了體外擴(kuò)增培養(yǎng),并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖活性、染色體屬性以及細(xì)胞標(biāo)志蛋白和功能蛋白的表達(dá)進(jìn)行了鑒定。光鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),體外擴(kuò)增培養(yǎng)的第1批65代HCE細(xì)胞形成匯合單層時(shí)呈多角形的六邊形內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài),第28批63代HCS細(xì)胞形態(tài)呈梭型,仍然具有其原有細(xì)胞的形態(tài)特征；生長與增殖活性的檢測結(jié)果顯示,HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為48.54 h和38.28 h,仍保持有旺盛的體外增殖能力；染色體組型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩種細(xì)胞的特征性染色體數(shù)目均為2n=46條,仍具有人類染色體的特征；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示,HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞仍分別保持有HCE細(xì)胞標(biāo)志蛋白——人血管內(nèi)皮生長因子受體-2(FLK-1)和HCS細(xì)胞標(biāo)志蛋白——波形蛋白的陽性表達(dá),表明兩種細(xì)胞仍保持有HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的固有屬性。對(duì)HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞功能蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCE細(xì)胞仍保持有細(xì)胞連接形成蛋白——緊密連接蛋白1(ZO-1)、間隙連接蛋白-43(CX-43)和整聯(lián)蛋白βv/β5以及膜運(yùn)輸?shù)鞍住狽a+/K+-ATPase的陽性表達(dá),而HCS細(xì)胞保持有CX-43和整聯(lián)蛋白β1以及Na+/K+-ATPase和乙醛脫氫酶3(ALDH3)的陽性表達(dá),證明這兩種細(xì)胞均仍然保持有形成細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間細(xì)胞連接和執(zhí)行膜運(yùn)輸功能的潛能,且HCS細(xì)胞保持有抗紫外損傷的潛能。上述鑒定結(jié)果證明,第65代HCE細(xì)胞和第63代HCS細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細(xì)胞屬性正常,增殖能力旺盛,并依然保持有形成細(xì)胞連接和執(zhí)行膜運(yùn)輸功能的潛能,符合作為組織工程角膜種子細(xì)胞的各項(xiàng)條件,可以被用于TE-pHC體外構(gòu)建的種子細(xì)胞。為了獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然角膜類似的TE-pHC載體支架,本文以新鮮豬角膜為材料進(jìn)行了aPCS-DM支架的制備和鑒定。我們利用凍融循環(huán)聯(lián)合核酸酶消化的方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理,經(jīng)核黃素交聯(lián)及風(fēng)干處理,獲得了aPCS-DM載體支架。用于構(gòu)建TE-pHC前,分別對(duì)光學(xué)性能、組織結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和機(jī)械性能進(jìn)行了檢測和評(píng)價(jià)。光學(xué)性能檢測結(jié)果顯示,aPCS的透明度和透光率近似于天然角膜,具有良好的光學(xué)性能。組織學(xué)檢查結(jié)果顯示,經(jīng)過脫細(xì)胞處理后aPCS膠原板層仍保持排列規(guī)則且結(jié)構(gòu)致密,后彈力層完整且表面平整,異種細(xì)胞在處理過程中被去除；理化性質(zhì)檢測結(jié)果顯示,含水量略高于天然角膜,aPCS中DNA殘留量低且符合醫(yī)用生物材料標(biāo)準(zhǔn),糖胺聚糖分布與天然角膜相似。生物力學(xué)性能檢測結(jié)果顯示,aPCS在生物力學(xué)性能上與天然角膜無顯著差異。上述結(jié)果表明,本文制備的aPCS-DM支架具有良好的光學(xué)性能,三維組織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似,生物力學(xué)性能優(yōu)良,滿足作為構(gòu)建TE-pHC的載體支架材料的要求。為了進(jìn)一步檢測載體支架與兩種細(xì)胞的生物相容性,本文對(duì)aPCS支架進(jìn)行了細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)和接種細(xì)胞后的免疫組織化學(xué)檢測。利用HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性的檢測結(jié)果顯示,制備的aPCS無細(xì)胞毒性作用。接種HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞后aPCS的的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞在載體支架內(nèi)部和后彈力層表面均能陽性表達(dá)其標(biāo)志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白。上述結(jié)果綜合表明,aPCS支架不僅無細(xì)胞毒性,還能夠?yàn)榧?xì)胞的黏附、增殖和功能表達(dá)提供合適的三維空間結(jié)構(gòu),具備良好的生物相容性,是作為TE-pHC體外構(gòu)建的理想支架材料。在已獲得種子細(xì)胞和載體支架的前提下,為了構(gòu)建具有功能的TE-pHC,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了TE-pHC的體外構(gòu)建并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。本文通過比較HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的不同接種方式和摸索細(xì)胞接種時(shí)間建贏了TE-pHC的構(gòu)建技術(shù)路線：微量注射的方法將HCS細(xì)胞接種于aPCS支架的基質(zhì)中,培養(yǎng)24 h后將接種過HCS細(xì)胞的植片后彈力層面向上直接法接種HCE細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)至4天,從而構(gòu)建出TE-pHC.對(duì)TE-pHC進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)和功能檢查,茜素紅染色結(jié)果說明HCE細(xì)胞在后彈力層面形成連續(xù)的單層,細(xì)胞密度為2910±420個(gè)／mm2的密度,相當(dāng)于健康成人30歲左右的內(nèi)皮細(xì)胞密度；HE染色結(jié)果顯示HCS細(xì)胞在注射點(diǎn)附近支架黏附并伸展,向周圍擴(kuò)散分布,HCE細(xì)胞連續(xù)完整單層與后彈力層結(jié)合緊密; TE-pHC的電鏡結(jié)果顯示,HCE細(xì)胞在aPCS后彈力層上形成的單層細(xì)胞表面平整,細(xì)胞與細(xì)胞連接緊密,兩種細(xì)胞與支架材料間均形成連接結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示構(gòu)建的TE-pHC中HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞標(biāo)志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白表達(dá)均呈陽性。上述結(jié)果表明構(gòu)建的TE-pHC在組織結(jié)構(gòu)上近似于人角膜后板層,HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞功能蛋白正常表達(dá),具有發(fā)揮后板層生物學(xué)功能的潛能。綜上所述,本文利用在體外擴(kuò)增培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細(xì)胞屬性正常,增殖能力旺盛的非轉(zhuǎn)染HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞,以光學(xué)性能優(yōu)良,組織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似,生物相容性和機(jī)械力學(xué)性能良好的aPCS-DM為載體支架,經(jīng)體外構(gòu)建5天后即可獲得形態(tài)組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能與活體角膜后板層高度近似的TE-pHC,具有發(fā)揮其生物學(xué)功能的潛能。這些研究結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)在體外成功構(gòu)建的TE-pHC,既可作為體外角膜實(shí)驗(yàn)的良好模型,又兼具后板層半角膜移植等效替代物的應(yīng)用前景。TE-pHC體外構(gòu)建技術(shù)的建立及形態(tài)結(jié)構(gòu)正常TE-pHC的獲得,為其替代捐獻(xiàn)角膜用于后板層角膜異常病變的臨床治療創(chuàng)造條件,也可替代組織工程人全層角膜用于角膜緣完好的全層角膜異�；颊叩拇┩感园鍖右浦�,不僅科學(xué)意義重大,社會(huì)意義和應(yīng)用價(jià)值重大,為組織工程角膜的臨床應(yīng)用奠定了體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Corneal ( Cornea ) is a transparent tissue located on the eyeball ' s surface . It is an important structure to maintain the function of cornea . In vitro construction of tissue engineering cornea requires that the seed cells have the potential to maintain the innate morphological structure , vigorous proliferation ability , stable hereditary ability and intrinsic function . The carrier scaffold with proper amount of human corneal stroma ( HCS ) is composed of 200 - 250 collagen plate structures and HCS cells distributed in a staggered manner , accounting for 90 % of the corneal thickness , and plays a key role in corneal thickness and transparency maintenance .
Human corneal endothelium ( HCE ) is located in the innermost layer of cornea . It is a natural barrier of cornea and anterior chamber .
The results showed that the population doubling time of HCE cells and HCS cells was 48.54 h and 38.28 h , respectively .
The results showed that the number of characteristic chromosomes of these two cells was 2n = 46 , which still possessed the characteristics of human chromosome ;
The results showed that both HCE cells and HCS cells had the potential to form cell - linked protein 1 ( ZO - 1 ) , gap junction protein - 43 ( CX - 43 ) and integrin 尾v / 尾5 and membrane transport protein _ Na + / K + - ATPase .
The results showed that aPCS scaffold had good optical properties , and its biological mechanical properties were similar to those of natural cornea . The results showed that the aPCS scaffold had good optical properties , and it could be used as the ideal scaffold material for the construction of TE - pHC .
The results showed that the TE - pHC was successfully constructed in vitro . The results showed that TE - pHC was successfully constructed in vitro .

【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08;R779.65

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 邢國長;韓煥清;于宏;應(yīng)國華;王靜一;李向印;;大鼠肺表面活性物質(zhì)系統(tǒng)起源結(jié)構(gòu)與板層體超微結(jié)構(gòu)的研究[J];解剖學(xué)報(bào);1982年01期

2 龍作戰(zhàn);;板層角(月末)移植治療蠶蝕性角(月末)潰瘍一例[J];延邊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1978年01期

3 張華梅;茹永新;;含核糖體-板層復(fù)合結(jié)構(gòu)前體的急性單核細(xì)胞白血病2例[J];中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2007年01期

4 邢國長,韓煥清;粉塵對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞板層體影響的研究[J];中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志;1983年01期

5 齊穎,李志輝,陸文秀,周躍華,安偉麗,孟玉玲;自動(dòng)板層成形聯(lián)合準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)治療高度近視[J];中國實(shí)用眼科雜志;1998年09期

6 鄭瑞瓊,邱孝芝,金岫云;角膜反板層的實(shí)驗(yàn)與臨床[J];眼科研究;1987年01期

7 魏湛云，傅瑞，，范祖慈;板層角移排斥反應(yīng)后的早期再移植[J];眼科新進(jìn)展;1995年04期

8 龍雙漣,吳良芳,保天然;部分去背根傳入貓脊髓Ⅱ板層神經(jīng)生長因子的免疫組化研究[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1997年04期

9 余戍;周利華;余騰;;眼球全周板層切除與前節(jié)循環(huán)[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1985年S1期

10 董紅心,吳良芳;貓部分去傳入脊髓Ⅱ板層內(nèi)突觸性終末的可塑性變化-電鏡定量研究[J];解剖學(xué)雜志;1995年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 龐鑫;組織工程人后板層半角膜體外構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 牛志強(qiáng);角膜深板層內(nèi)皮移植的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2005年

2 凌玲;后部板層角膜供體材料的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)研究[D];南昌大學(xué);2012年

本文編號(hào)：1696256