本文選題：甲狀腺相關眼病　切入點：前脂肪細胞　出處：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景:隨著現(xiàn)代社會環(huán)境、社會人群心理狀態(tài)及生活習慣的改變,甲狀腺相關眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)的發(fā)病率呈現(xiàn)一種逐漸上升趨勢。在美國每年大約有37000例新發(fā)病例,每10萬人口年平均約有16例女性和2.9例男性發(fā)病的患者。它是一種與內分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)相關疾病,確切的發(fā)病機制不清楚,最近研究表明Ig G4可能與它也存在一定相關性。該病多雙眼發(fā)病,以眼球突出、眼瞼腫脹退縮、上瞼遲落、結膜充血水腫、眼外肌麻痹等為主要臨床表現(xiàn),嚴重時可由于眶內肌肉組織壓迫視神經或眼球過于突出而形成暴露性角膜炎導致失明。從病理學來看,它主要是由于眶內脂肪組織增多和眼外肌肥厚纖維化及炎性病變?yōu)樘攸c。其中眶內脂肪組織病變在發(fā)病中占據了很重要的作用。作為自身免疫性疾病促甲狀腺素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)多年來被認為是TAO自身免疫主要抗原。但對于自身抗原究竟是一種還是多種參與一直沒有定論。在早期的研究中就曾經發(fā)現(xiàn)TSHR抗體免疫沉淀復合物可以有效地作用在胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor receptor-1,IGF-1R)上,并且認為它可能參與了疾病發(fā)展過程。近幾年有學者通過實驗提出了TSHR/IGF-1R的復合共同體學說,他們通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)IGF-1Rβ亞單位與TSHR共同存在于Graves’眼病(Graves’ophthalmopathy,GO)患者眼眶成纖維細胞和甲狀腺上皮細胞中,加入IGF-1R的拮抗劑后可以明顯抑制GD-Ig G的信號傳導作用。后期的動物模型實驗也進一步證實了IGF-1R在TAO的發(fā)病中起了很關鍵的作用。而作為IGF-1R的配體胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是組織生長代謝的重要因子,它可以促進成纖維組織透明質酸鈉及粘多糖的合成,而GO眼眶組織病理改變與粘多糖沉積有直接的關系。雖然IGF-1主要來源于肝臟組織細胞但也在其他組織中發(fā)現(xiàn)分泌現(xiàn)象,敲除基因小鼠的實驗里發(fā)現(xiàn)脂肪組織中IGF-1升高明顯,推測脂肪組織也可能分泌IGF-1。在甲狀腺相關眼病的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)疾病組中血清IGF-1較對照組有明顯升高。另外Delu在實驗中發(fā)現(xiàn)甲狀腺相關性眼病患者中成纖維細胞存在IGF-1自分泌的現(xiàn)象。以上都表明IGF-1R及配體IGF-1可能在TAO發(fā)病中發(fā)揮一定作用。IGF-1自發(fā)現(xiàn)以來就不斷被證實并認為它和與機體內許多組織的增殖生長及分泌功能有密切聯(lián)系。作為與胰島素家族類似的一種蛋白,IGF-1有著與胰島素很多相似的作用。已經有研究表明胰島素可以促進脂肪細胞分泌纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),PAI-1在體內的主要作用是調節(jié)組織型纖溶酶原激活(tissue-type plasminogen activator,t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活(urokinase-type plasminogen activator,u-PA)兩者之間的代謝平衡,通過影響細胞外基質中膠原蛋白代謝平衡而改變纖維化過程,這在肺、肝、皮膚等組織纖維化相關研究中都被證實。在對TAO患者淚液分析研究中發(fā)現(xiàn)GO組患者淚液中的PAI-1蛋白比Graves’病(Graves’disease,GD)組有明顯的提高,而且與病情的活動程度有一定相關性。雖然具體相關機制還不清楚但這給了我們一些提示:GO患者眼眶組織中有可能存在PAI-1異常分泌的現(xiàn)象。TAO的發(fā)病除了與免疫性自身抗原有著明確的關系外,體內其他一些生理機制的紊亂和異常也是導致其發(fā)生的重要原因。作為體內一種重要內在平衡機制的自噬是一種基因程序性的調控行為,在組織生長代謝及自我保護方面起了重要作用。在一般生理情況下它通過降解或重新利用細胞器及相關蛋白來維持細胞自身的代謝平衡;在病理情況下則為細胞器的自身修復和再生提供必需的原料。自噬過程與人類很多疾病都關系緊密,其中也包括我們常見的一些自身免疫性疾病。比如在脫髓鞘和多發(fā)性硬化疾病相關研究過程中發(fā)現(xiàn)自噬蛋白Atg5在組織中出現(xiàn)了異常高表達現(xiàn)象。此外實驗發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分化的過程也有自噬活動的參與,在小鼠胚胎成纖維細胞誘導分化時通過電鏡可以觀察到自噬小體含量的增加。IGF-1R作為細胞重要的受體也參與了體內一些組織自噬過程。盡管如此,甲狀腺相關眼病的發(fā)病是否與自噬活動有關還不清楚。本研究是建立在上述研究背景條件下,對眼眶脂肪組織及細胞進行相關基礎實驗研究。第一部分首先主要通過對眼眶脂肪組織進行IGF-1R蛋白及m RNA檢測,希望了解TAO患者與對照組之間是否存在差異及蛋白分布情況;其次通過對原代眼眶前脂肪細胞進行提取、培養(yǎng)、鑒定后,探討IGF-1對兩組細胞增殖能力的影響;最后觀察分化過程中IGF-1R變化和IGF-1自分泌情況及脂化作用;第二部分主要是了解TAO患者眼眶脂肪組織中PAI-1是否存在異常表達及分布情況,在前脂肪細胞分化過程中探討IGF-1對PAI-1的合成影響及相關機制;第三部分是通過對自噬標志性LC3蛋白進行檢測對比TAO組和對照組患者眼眶脂肪組織中自噬水平變化情況,并探討眼眶前脂肪細胞分化過程是否存在自噬過程及影響其水平的相關機制。研究方法:1.應用Western Blot和RT-PCR方法對TAO組和對照組的眼眶脂肪組織IGF-1R、PAI-1、LC3進行檢測;2.應用免疫組化技術對TAO組和對照組的眼眶脂肪組織冰凍切片行IGF-1R、PAI-1定位及半定量檢測;3.提取眼眶脂肪組織的原代前脂肪細胞,對其進行培養(yǎng)、傳代,利用Pref-1特異性抗體通過流式細胞儀對前脂肪細胞細胞進行鑒定及篩選;4.使用CCK8技術觀察不同濃度IGF-1(0n M,1n M,5n M,10n M,20n M)對眼眶前脂肪細胞增殖再生能力的影響;5.利用Western Blot技術觀察眼眶前脂肪細胞不同分化時間階段LC3、Atg5及分化前后IGF-1R蛋白表達情況;通過RT-PCR檢測分化后PAI-1、PPARγ、IGF-1的變化情況;6.不同濃度IGF-1(0n M,1n M,5n M,10n M,20n M)作用于分化的TAO前脂肪細胞組了解LC3、Atg5蛋白表達情況;通過RT-PCR檢測分化后PAI-1、PPARγ的變化情況;并利用油紅O染色檢測脂肪化程度;7.觀察PI3k抑制劑LY294002、AKT抑制劑MK2206對IGF-1作用下TAO前脂肪細胞分化時的作用,通過Western Blot檢測LC3、Atg5蛋白表達的變化情況,同時了解分化后PAI-1、PPARγ的改變情況。研究結果:1.Western Blot和免疫組化顯示TAO脂肪組織中IGF-1R、PAI-1蛋白表達量高于對照組;而LC3蛋白表達量低于對照組;2.TAO及對照組眼眶前脂肪維細胞體外分化無明顯差異;3.IGF-1可以促進眼眶前脂肪細胞增殖,在TAO組更為明顯;4.TAO組前脂肪細胞IGF-1R蛋白在分化前后表達量高于對照組;5.TAO組前脂肪細胞分化過程中早期的LC3、Atg5表達與分化后PAI-1、PPARγm RNA表達與對照組無明顯差別;而IGF-1 m RNA表達量在TAO組要高于對照組;6.IGF-1抑制前脂肪細胞分化過程中LC3、Atg5蛋白表達,促進PAI-1m RNA、PPARγm RNA的表達;7.IGF-1R通過PI3K/AKT信號傳導通路來調控前脂肪細胞分化中PAI-1m RNA、PPARγm RNA和LC3、Atg5蛋白的表達。結論:1.TAO眼眶脂肪組織及脂肪細胞高表達IGF-1R,IGF-1可以促進眼眶前脂肪細胞增殖和分化;2.TAO眼眶前脂肪細胞分化過程中IGF-1自分泌明顯增強;3.自噬在TAO眼眶脂肪組織中水平較低,前脂肪細胞體外分化早期階段可見較明顯自噬;4.TAO眼眶脂肪組織表達較多PAI-1,IGF-1可以促進眼眶前脂肪細胞PAI-1的表達;5.IGF-1R可以通過PI3K/AKT信號通路調控前脂肪細胞分化和LC3、Atg5、PAI-1的表達。
[Abstract]:In recent years , there are about 37,000 new cases of thyroid - associated ophthalmos ( TSHR ) . In this study , it was found that the expression of PAI - 1 in the tears of the patients with GO was significantly higher than that of Graves ' disease . The expression of IGF - 1R and PPAR緯 was detected by Western Blot and Western Blot . The expression of IGF - 1R and PPAR緯 in the preadipocytes was higher than that in the control group . Conclusion : 1 . The expression of PAI - 1 mRNA , PPAR緯 mRNA and LC3 and Atg5 protein in preadipocytes were regulated by IGF - 1R signaling pathway .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R581;R771.3

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本文編號：1688499