發(fā)布時(shí)間：2018-03-23 03:16

  本文選題：APCM　切入點(diǎn)：組織工程角膜支架　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：角膜疾病占全世界致盲性眼病的第二位,全世界超過1000萬人因?yàn)榻悄ぜ膊《旅�。目�?對(duì)于角膜盲患者來說,角膜移植仍然是唯一確切有效的治療方法。但是因?yàn)槟壳熬璜I(xiàn)的角膜材料嚴(yán)重缺乏,而使很多因角膜疾病而致盲的患者很難獲得及時(shí)而且有效的治療。因角膜供體缺乏,我國(guó)每年實(shí)施手術(shù)的病人還不到4000例,而每年需行角膜移植的患者卻達(dá)到約30萬。在這種情況下,人造角膜替代品成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。人工角膜(Keratoprosthesis)雖然已被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床,但因生物相容性差、術(shù)后并發(fā)癥多,難以在臨床上推廣。組織工程角膜(Tissue-engineered cornea,TECs)角膜是將體外培養(yǎng)的角膜細(xì)胞接種于可降解的生物支架材料上構(gòu)建的與天然角膜具有相似的功能和結(jié)構(gòu)的角膜替代物。因?yàn)槠渖锵嗳菪跃吡己玫?而受到了廣泛的關(guān)注。角膜組織工程在近幾十年來研究取得了較大進(jìn)展。脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(Acellular porcine cornea matrix,APCM)及重組的人膠原在臨床或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物前板層角膜移植中取得良好效果。但對(duì)于多種角膜疾病來說,如圓錐角膜、角膜穿孔等,穿透性角膜移植仍是廣泛應(yīng)用的手術(shù)方式。由于傳統(tǒng)觀念的影響,在我國(guó)角膜捐獻(xiàn)率較低,而角膜屈光手術(shù)的開展使適于穿透性移植的角膜供體進(jìn)一步減少。構(gòu)建組織工程全厚角膜植片是解決當(dāng)前穿透性角膜移植供體不足問題的可行的方法。此外,角膜所包含的細(xì)胞類型相對(duì)較少,主要有內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞。相對(duì)于其他器官來說,構(gòu)建TECs角膜更簡(jiǎn)單、易行。TECs的兩個(gè)關(guān)鍵成分是種子細(xì)胞以及其支架材料。脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(Acellular porcine cornea matrix,APCM)具有正常角膜的關(guān)鍵特性,如良好的透明性和生物相容性、與天然角膜相似的力學(xué)特性、低免疫原性、可耐受手術(shù)縫合等。對(duì)于TECs的構(gòu)建來說,其是一種良好的支架材料。此外,豬角膜來源非常廣泛。所以,在本研究中我們擬選用已經(jīng)脫除了細(xì)胞的豬角膜基質(zhì)(脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(Porcine cornea matrix,PCM)作為組織工程全厚角膜的支架。以往文獻(xiàn)報(bào)道APCM在基質(zhì)囊袋植入術(shù)后可維持一年不降解,且角膜基質(zhì)細(xì)胞在移植術(shù)后3周可遷入其內(nèi)。鑒于此,角膜基質(zhì)細(xì)胞在組織工程全厚角膜構(gòu)建中未接種。但豬角膜的厚度大于人角膜,經(jīng)脫細(xì)胞程序后,其厚度進(jìn)一步增加,而植片與植床厚度不匹配可影響角膜移植術(shù)后切口的愈合。因此,在以脫細(xì)胞豬角膜為支架的組織工程全厚角膜的構(gòu)建中,如何制備與天然角膜厚度相似的脫細(xì)胞豬角膜片層是首先需要解決的問題。種子細(xì)胞作為構(gòu)建TECs中的又一關(guān)鍵成分,需要具備來源廣泛、可在體外大量擴(kuò)增等特點(diǎn)。但原代培養(yǎng)的人角膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力有限,而經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的角膜細(xì)胞系具有潛在的致瘤性,限制了其臨床應(yīng)用。胚胎干細(xì)胞(Human embryonic stem cells,hESCs)因具有強(qiáng)大的增殖能力和分化全能性,可向機(jī)體三個(gè)胚層的細(xì)胞分化,近年來成為組織工程中種子細(xì)胞的一個(gè)重要的來源。在我們前期研究中已建立了人胚胎干細(xì)胞在體外向角膜緣上皮樣細(xì)胞和角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的方法。誘導(dǎo)的角膜緣上皮樣細(xì)胞和角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞與原代培養(yǎng)的細(xì)胞具有相似的形態(tài)和功能,可作為TECs的種子細(xì)胞的來源。角膜的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分別位于角膜前后兩面。因此,為了模擬正常角膜結(jié)構(gòu),建立一個(gè)可于支架前后兩面同時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的三維培養(yǎng)方案也是函待解決的問題。綜上所述,在本研究中,我們首先開發(fā)了一個(gè)可制備與天然角膜厚度相似的APCM支架的切割工具。其次,建立了可用于APCM前后兩面同時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的三維培養(yǎng)方案。并通過該培養(yǎng)方案將胚胎干細(xì)胞來源的角膜緣上皮樣(Limbal epithelial cell-like,LEC-like)細(xì)胞和角膜內(nèi)皮樣(Corneal endothelial cell-like)細(xì)胞作為種子細(xì)胞接種于APCM支架嘗試構(gòu)建組織工程全厚角膜,探討該培養(yǎng)方案用于構(gòu)建組織工程全厚角膜的可行性。本研究發(fā)現(xiàn)制備的脫細(xì)胞豬角膜支架與天然角膜具有相似的厚度和生物力學(xué)特性。以其為支架,通過我們建立的三維培養(yǎng)方案構(gòu)建的組織工程全厚角膜與天然角膜相似,可形成復(fù)層的上皮和單層的內(nèi)皮,且分別表達(dá)角膜上皮和角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物。TECs內(nèi)皮細(xì)胞的密度和生物力學(xué)特性也與天然角膜相似,并在體內(nèi)表現(xiàn)出一定的功能。但是該植片的透明度與天然角膜相比仍存在一定的差距,還需要在以后的研究中進(jìn)一步改進(jìn)。第一部分APCM支架的制備[目的]探討使用我們自行設(shè)計(jì)的APCM切割工具制備的APCM片層是否可用作組織工程全厚角膜的支架。[方法]1.豬角膜脫細(xì)胞程序:首先新鮮的豬眼球放置于超凈工作臺(tái)中,使用含1%青霉素與1%鏈霉素的高溫滅菌的PBS充分洗滌。使用角膜穿刺刀和角膜剪取下角膜,中央11mm的角膜使用環(huán)鉆鉆下,然后使用1.5mol/L的無菌氯化鈉溶液及5U/ml的DNA/RNA酶處理,脫除豬角膜的細(xì)胞成分。2.脫細(xì)胞豬角膜片層的切割:將脫完細(xì)胞的豬角膜置于我們自行設(shè)計(jì)的切割工具內(nèi),通過加壓排出脫細(xì)胞豬角膜內(nèi)的水分,將切割工具的刻度調(diào)整至400μm,使用薄刀片沿右側(cè)加壓塊切割豬角膜基質(zhì)前板層(如第一部分圖2所示),作為組織工程角膜的支架,-20℃無菌保存?zhèn)溆谩?.APCM支架的生物學(xué)特性檢測(cè):HE及DAPI染色檢測(cè)APCM支架中細(xì)胞脫除情況。免疫熒光法檢測(cè)角膜上皮的基底膜成分collagen Ⅳ和laminin的表達(dá),評(píng)價(jià)經(jīng)脫細(xì)胞處理的支架的上皮基底膜是否完整。測(cè)量樣品含水量,使用千分尺測(cè)量支架的厚度,分光光度計(jì)測(cè)量支架的透明度,Instron電子拉伸機(jī)測(cè)量支架的生物力學(xué)強(qiáng)度。[結(jié)果]HE和DAPI染色顯示APCM支架內(nèi)未見明顯的細(xì)胞以及細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)殘留,支架內(nèi)膠原保存完好,無明顯斷裂。免疫熒光染色可在APCM支架前表面檢測(cè)到連續(xù)的collagen Ⅳ和laminin表達(dá)。APCM支架的厚度和生物力學(xué)強(qiáng)度與正常兔角膜相似,含水量略高于正常兔角膜,但透光度略低于正常兔角膜,而經(jīng)甘油脫水后其透光度增加,甚至略高于正常兔角膜。[結(jié)論]高滲鹽聯(lián)合DNA/RNA酶可有效去除豬角膜內(nèi)的細(xì)胞成分,并保留了上皮細(xì)胞基底膜。切割后的APCM支架與正常兔角膜厚度和生物力學(xué)強(qiáng)度相似,可以用作組織工程全厚角膜構(gòu)建的支架材料。第二部分hESCs體外分化為L(zhǎng)EC-like和CEC-like細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[目的]體外誘導(dǎo)hESCs分化為L(zhǎng)EC-like細(xì)胞和CEC-like細(xì)胞,并分選純化ABCG2陽性的LEC-like細(xì)胞和N-cadherin陽性的CEC-like細(xì)胞。[方法]1.hESCs的培養(yǎng)和表型檢測(cè):將hESCs H1細(xì)胞株培養(yǎng)于Matrigel包被的培養(yǎng)板中,使用mmTeSRl培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每5天傳代。免疫熒光法檢測(cè)hESCs標(biāo)記物OCT4及SSEA-3的表達(dá)。2.人角膜緣上皮細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定:(1)角膜緣上皮細(xì)胞(Limbal epithelial cells,LECs)培養(yǎng):角膜移植術(shù)后剩余的角膜環(huán)經(jīng)含1%青霉素-鏈霉素的PBS充分沖洗后,顯微鏡下剝除后彈力層,然后置于2.4U/ml的dispase Ⅱ中消化1.5小時(shí),0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分鐘,將消化下來的LECs置于2%去生長(zhǎng)因子Matrigel包被的培養(yǎng)皿培養(yǎng)。熒光免疫法檢測(cè)LEC細(xì)胞的標(biāo)記物ABCG2、p63及CK3的表達(dá);(2)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞(Corneal stromal fibroblasts,CSFs)培養(yǎng):殘余的組織塊使用剪刀修剪成約1mm3大小,置于0.02%的膠原酶A中繼續(xù)消化2小時(shí),離心后接種于培養(yǎng)皿,使用含胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。熒光免疫法檢測(cè)CSF細(xì)胞標(biāo)記物vimentin和α-SMA的表達(dá)。3.條件培養(yǎng)基的收集與配制:(1)LEC細(xì)胞條件培養(yǎng)基的配制:根據(jù)我們以前研究結(jié)果,將收集的LEC細(xì)胞培養(yǎng)基與其原培養(yǎng)基以3:1比例混合作為L(zhǎng)EC細(xì)胞條件培養(yǎng)基;(2)角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基的制備:根據(jù)我們以前研究結(jié)果,晶狀體上皮細(xì)胞系生長(zhǎng)到700%-90%融合時(shí),每12小時(shí)收集培養(yǎng)基,與CSF細(xì)胞培養(yǎng)基以3:1比例混合作為CEC-like細(xì)胞分化培養(yǎng)基。兩種條件培養(yǎng)基均經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌后,保存在-80℃冰箱備用。4.體外誘導(dǎo)hESCs分化為L(zhǎng)EC-like細(xì)胞和CEC-like細(xì)胞:(1)hESCs經(jīng)2mg/ml的dispase酶消化后置于低粘附培養(yǎng)皿中,使用擬胚體(Embryoid bodies,EBs)培養(yǎng)基培養(yǎng)形成EBs。(2)按照我們以往報(bào)道的方法誘導(dǎo)hESCs分化為L(zhǎng)EC-like和CEC-like細(xì)胞。LEC-like細(xì)胞的誘導(dǎo):Ⅳ型膠原包被培養(yǎng)板,24孔板每孔中接種10-15個(gè)EBs,使用角膜緣上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)9天,誘導(dǎo)其分化為L(zhǎng)EC-like細(xì)胞。CEC-like細(xì)胞的誘導(dǎo):纖連蛋白、層黏連蛋白以及硫酸軟骨素包被液包被的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔接種80個(gè)EBs,通過Transwell與CSF細(xì)胞共培養(yǎng)5天,隨后去除CSF細(xì)胞,使用CEC-like細(xì)胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周,誘導(dǎo)其分化為CEC-like細(xì)胞。5.LEC-like細(xì)胞和CEC-like細(xì)胞的表型鑒定和純化:(1)LEC-like細(xì)胞表型的鑒定和純化:熒光免疫法檢測(cè)ABCG2、p63和CK3的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)分選ABCG2陽性的細(xì)胞,作為L(zhǎng)EC-like細(xì)胞;(2)CEC-like細(xì)胞表型鑒定和純化:免疫熒光法檢測(cè)N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)分選N-cadherin陽性的細(xì)胞作為CEC-like細(xì)胞。[結(jié)果]誘導(dǎo)的LEC-like細(xì)胞呈鋪路石樣,高表達(dá)ABCG2,p63和CK3,與原代培養(yǎng)的LEC細(xì)胞相似。誘導(dǎo)的CEC-like細(xì)胞呈多邊形,在EBs周圍形成內(nèi)皮細(xì)胞單層,CEC細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶熒光免疫染色呈陽性。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示誘導(dǎo)的LEC-like細(xì)胞中ABCG2陽性的細(xì)胞約為34.94%,誘導(dǎo)的CEC-like細(xì)胞中N-cadherin陽性的細(xì)胞約10.91%。流式細(xì)胞術(shù)分選的LEC-like 細(xì)胞共表達(dá) ABCG2 和 p63,分選的 CEC-like 共表達(dá) N-cadherin、ZO-1和 Na+/K+ ATP 酶。[結(jié)論]我們誘導(dǎo)的LEC-like細(xì)胞和CEC-like細(xì)胞分別與原代培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出相似的形態(tài)和標(biāo)記物表達(dá)。通過細(xì)胞分選可獲取純度較高的LEC-like細(xì)胞和CEC-like細(xì)胞。第三部分組織工程全厚角膜的構(gòu)建和體內(nèi)功能的檢測(cè)[目的]探討使用我們建立的三維培養(yǎng)方案構(gòu)建組織工程全厚角膜的可行性,并進(jìn)一步檢測(cè)構(gòu)建的組織工程角膜的生物學(xué)特性和體內(nèi)功能,評(píng)估其用于穿透性角膜移植(Penetrating keratoplasty,PKP)的可行性。[方法]1.CEC-like細(xì)胞和LEC-like細(xì)胞的接種:將APCM支架置于我們開發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)的中空插件內(nèi)(如第三部分圖1所示),基質(zhì)面朝上,將CEC-like細(xì)胞按3000/mm2接種于基質(zhì)面,培養(yǎng)兩周。隨后反轉(zhuǎn)構(gòu)建物,使其前彈力層面朝上,然后按照1.5×1 04/mm2的密度接種LEC-like細(xì)胞。培養(yǎng)基沒過構(gòu)建物培養(yǎng)1周,隨后改為氣液界面法繼續(xù)培養(yǎng)1周,促進(jìn)上皮形成復(fù)層。2.組織工程角膜形態(tài)及生物學(xué)特性檢測(cè):HE染色觀察組織工程角膜的組織形態(tài)。熒光免疫法檢測(cè)組織工程角膜上皮及內(nèi)皮標(biāo)記物的表達(dá)。臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅染色,隨后于顯微鏡下計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞密度。使用千分尺測(cè)量組織工程角膜的厚度,分光光度計(jì)測(cè)量其的透光度,Instron電子拉伸機(jī)測(cè)量其生物力學(xué)強(qiáng)度。3.穿透性角膜移植:實(shí)驗(yàn)組以組織工程全厚角膜作為植片進(jìn)行PKP手術(shù)。對(duì)照組:以APCM支架為植片,其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。術(shù)后行裂隙燈檢查、眼壓測(cè)量以及眼前節(jié)OCT檢查,觀察組織工程角膜植片透明度和厚度變化、角膜新生血管生長(zhǎng)及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后8周行共聚焦激光角膜顯微鏡檢查觀察內(nèi)皮情況。4.組織學(xué)觀察:術(shù)后1、2、4和8周分別摘除1只家兔角膜,HE染色觀察術(shù)后組織工程角膜和APCM支架上皮和內(nèi)皮的變化、基質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)入和浸潤(rùn)的炎細(xì)胞�？谷撕丝贵w追蹤TECs內(nèi)人角膜細(xì)胞在移植術(shù)后的變化。免疫熒光法檢測(cè)移植術(shù)后TECs上皮及內(nèi)皮標(biāo)記物的表達(dá)。[結(jié)果]1.組織工程全厚角膜生物學(xué)特征的體外檢測(cè):HE染色可見構(gòu)建物形成3-4層上皮和單層的內(nèi)皮。免疫熒光染色顯示:在構(gòu)建物上皮層中,角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK3呈陽性,部分基底部細(xì)胞中角膜緣干細(xì)胞標(biāo)記物ABCG2呈陽性,但未檢測(cè)到p63的表達(dá)。構(gòu)建物內(nèi)皮中CEC細(xì)胞標(biāo)記物Na+/K+ATP酶、N-cadherin和ZO-1。組織工程角膜與正常兔角膜具有相似的內(nèi)皮細(xì)胞密度、厚度和生物力學(xué)強(qiáng)度,但透光度略低于正常兔角膜。2.組織工程全厚角膜體內(nèi)功能的檢測(cè):穿透性角膜移植術(shù)后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組角膜植片厚度均增加,術(shù)后1周后,實(shí)驗(yàn)組植片開始變薄,透明度逐漸增加;對(duì)照組植片厚度逐漸增加,透明度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。2-4周時(shí)兩組中家兔的植片中開始出現(xiàn)新生血管,但在對(duì)照組中,新生血管生長(zhǎng)更快,至術(shù)后8周時(shí)新生血管已經(jīng)長(zhǎng)滿植片,植片厚度平均為780μm,呈瓷白色,不透明。實(shí)驗(yàn)組至術(shù)后8周時(shí)新生血管長(zhǎng)入植片邊緣,厚度平均為460μm,透過植片可見虹膜。HE染色示:實(shí)驗(yàn)組植片各時(shí)間點(diǎn)均可見上皮和內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋,對(duì)照組至術(shù)后4周時(shí)可見上皮細(xì)胞覆蓋,但觀察期內(nèi)植片后表面未見內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)后2周時(shí)兩組植片中均可見炎細(xì)胞浸潤(rùn),但在觀察期內(nèi)未見炎細(xì)胞明顯增加�？谷撕丝贵w染色顯示:實(shí)驗(yàn)組在4周內(nèi)可檢測(cè)到抗人核抗體陽性的上皮細(xì)胞。術(shù)后8周時(shí)在植片上皮中未檢測(cè)到抗人核抗體陽性的細(xì)胞,但在內(nèi)皮還可以檢測(cè)到抗人核抗體陽性的細(xì)胞,而對(duì)照組中沒有檢測(cè)到抗人核抗體陽性的細(xì)胞。免疫熒光染色顯示:術(shù)后4周時(shí),移植的組織工程角膜上皮中可檢測(cè)到抗人CK3抗體染色陽性的細(xì)胞,但未檢測(cè)到人ABCG2和p63的表達(dá)。術(shù)后8周時(shí)抗人CK3陽性的細(xì)胞消失,但在植片內(nèi)皮面仍可檢測(cè)到表達(dá)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞。[結(jié)論]我們建立的三維培養(yǎng)方案可用于組織工程全厚角膜的構(gòu)建,構(gòu)建的角膜與天然角膜具有相似的內(nèi)皮細(xì)胞密度、厚度和生物力學(xué)強(qiáng)度。在體內(nèi),組織工程全厚角膜也表現(xiàn)出一定的天然角膜的生物學(xué)功能,且免疫排斥反應(yīng)并不重,但其透明度仍低于天然角膜。如何提高構(gòu)建的組織工程全厚角膜在體內(nèi)的透明度還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中再進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R779.65;R318.08
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本文編號(hào)：1651650