發(fā)布時間：2018-03-19 18:13

  本文選題：真菌性角膜炎　切入點：煙曲霉菌　出處：《青島大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:探討吲哚胺2,3雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)在真菌性角膜炎中的表達、介導真菌性角膜炎真菌免疫耐受的功能以及相關的模式識別受體對其調控的機制。方法:本研究分別在真菌性角膜炎患者、體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞真菌感染的細胞模型以及真菌性角膜炎小鼠動物模型上研究了IDO的表達規(guī)律、IDO介導真菌性角膜炎中真菌免疫耐受的功能及相關的模式識別受體對IDO及下游炎癥因子的調控機制。據此,實驗分以下三個方面:1.選擇2012年1月至2014年12月在青島大學附屬醫(yī)院眼科就診的真菌性角膜炎初診患者31例(31眼)為真菌感染組,根據角膜潰瘍的嚴重程度及裂隙燈下的炎癥評分分為輕、中、重度感染三組,收集角膜病灶周圍的角膜上皮組織;同時收集角膜移植中健康供體制作角膜植片后剩余的周邊角膜緣組織6例(6眼)為正常對照組,刮取植片的角膜上皮組織。免疫熒光法檢測臨床真菌性角膜炎患者角膜組織中IDO的表達與定位,q RT-PCR法檢測正常對照組和真菌性角膜感染組中IDO的表達差異及其與真菌性角膜炎感染嚴重程度之間的關系。建立C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染模型,免疫組織化學染色、q RT-PCR法、Western blot法進一步明確真菌性角膜炎角膜組織中IDO的表達規(guī)律。2.體外培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞,加入煙曲霉菌孢子刺激液,q RT-PCR檢測不同作用濃度及時間點角膜上皮細胞中IDO的表達,篩選作用顯著的刺激液;q RT-PCR及ELISA檢測1-MT(IDO特異性的抑制劑)預處理后煙曲霉菌刺激液誘導的角膜上皮細胞IDO表達的改變以及對IDO下游炎癥因子分泌的影響。將健康的C57BL/6小鼠隨機分為對照組(給予PBS飲水預處理,刮取直徑約2mm的中央角膜上皮,覆蓋角膜接觸鏡)、煙曲霉菌感染組(刮取直徑約2mm的中央角膜上皮后接種真菌,覆蓋角膜接觸鏡)和1-MT預處理+煙曲霉菌感染組(IDO的抑制劑1-MT飲水預處理后,刮取中央角膜上皮后接種真菌,再覆蓋角膜接觸鏡),根據感染的嚴重程度進行炎癥評分,收集小鼠的角膜行q RT-PCR、免疫熒光和流式細胞術,比較IDO阻斷前后角膜的感染嚴重程度的評分,檢測IDO的表達、定位及其對IDO下游的炎癥因子表達的影響,觀察IDO阻斷前后角膜、淋巴結及脾臟組織中Th17和Treg細胞含量之間的變化,從而分析IDO介導真菌免疫耐受的相關機制。3.(1)體外培養(yǎng)人的角膜上皮細胞,給予不同的模式識別受體Dectin-1、TLR2、TLR4的特異性配體,q RT-PCR篩選角膜上皮細胞中調控IDO表達的模式識別受體;(2)分別給予1-MT,Dectin-1的激動和抑制劑預處理,在煙曲霉菌孢子誘導的人角膜上皮細胞的IDO誘導模型上,應用q RT-PCR、ELISA和Western blot檢測Dectin-1對IDO及其下游炎癥因子的調控。結果:1.(1)對臨床真菌性角膜炎患者的病變角膜組織行免疫熒光染色在蛋白水平證實IDO在正常的角膜上皮組織中無或極少量的表達,而在煙曲霉菌性角膜炎患者角膜組織中IDO的表達明顯增加并主要表達于角膜上皮組織中。(2)在臨床真菌性角膜炎患者的角膜上皮組織中,q RT-PCR檢測顯示:與正常對照組相比,真菌性角膜炎患者的角膜上皮組織中的IDO m RNA表達明顯增加,并且隨著感染及炎癥程度的增加,IDO的表達升高越明顯,輕、中、重度各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染的模型中q RT-PCR結果顯示真菌感染后IDO m RNA表達明顯增高,1d達到高峰,之后開始降低。Western blot結果顯示IDO的蛋白水平在真菌感染后1d開始增加,3d達高峰。2.(1)在體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞中,滅活的煙曲霉菌孢子可以誘導上皮細胞中IDO的表達量增加,并呈現(xiàn)出濃度依賴的變化趨勢。q RT-PCR結果顯示:與煙曲霉菌孢子刺激組相比,1-MT預處理組角膜上皮細胞中IDO及下游通路因子IL-1β、IL-6表達增加,ELISA檢測在蛋白水平證實了相關的炎癥因子的變化。(2)在C57BL/6小鼠和1-MT預處理鼠的煙曲霉菌感染模型中,疾病評分顯示1-MT預處理鼠模型組的感染程度明顯重于單純的煙曲霉菌感染組,q RT-PCR、ELISA顯示:與AF組相比,AF+1-MT組鼠角膜中IDO及IDO下游通路因子IL-1β、IL-6表達明顯增加。q RT-PCR結果顯示Th17型細胞因子(IL-17、IL-23)表達增加,Treg型細胞因子(IL-10、TGF-β)表達減少。流式細胞術的檢查結果顯示,與AF組相比,IDO阻斷后小鼠真菌感染動物模型中角膜及脾臟組織中Th17細胞含量增加,Treg細胞含量減少,Th17/Treg細胞含量比增加,差異具有統(tǒng)計學意義。3.(1)采用不同的模式識別受體Dectin-1、TLR2、TLR4的特異性配體即Curdlan、Pam3csk4、LPS作用于角膜上皮細胞后,q RT-PCR檢測顯示TLR2、TLR4的特異性配體不能誘導IDO的表達,而真菌感染組和Dectin-1特異性的配體Curdlan組均能明顯地誘導IDO的表達。給予Dectin-1的激動劑和抑制劑能夠調控煙曲霉菌對IDO的刺激作用,Western blot檢測在蛋白水平證實了這一變化。結論:1.IDO及其下游炎癥因子在煙曲霉菌性角膜炎的發(fā)病機制中起重要作用。2.在煙曲霉菌感染的真菌性角膜炎中,煙曲霉菌可以通過Dectin-1/IDO這一信號通路,誘導角膜上皮細胞中IDO及其相關信號分子的表達,進而誘導Treg反應,抑制Th17反應,介導了煙曲霉菌的免疫耐受,促進了真菌性角膜炎炎癥反應的慢性化。3.IDO的調控影響了煙曲霉菌導致的真菌性角膜炎相關的炎癥反應,從而可能成為臨床上新的治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R772.2

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