本文關鍵詞： Smac 小干擾RNA 瞬時轉染 凋亡 內質網應激 人晶狀體上皮細胞　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景白內障是世界范圍內造成人類致盲的主要眼病。老齡人口的增長導致患病率也逐年上升。目前白內障復明的主要方法是手術治療。白內障手術的普及和人工晶狀體不斷地更新和完善給千百萬白內障患者重新帶來光明,并且國家每年出資委派醫(yī)療隊為貧困白內障患者免費手術治療,這無疑增加社會的經濟負擔。由于我國人口基數大,部分偏遠地區(qū)醫(yī)療條件差以及手術費用昂貴等諸多原因,仍有部分白內障患者無法得到有效的手術治療。因此研究白內障的發(fā)病機理對防治和延緩白內障的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。內質網在人體內發(fā)揮重要的調節(jié)代謝作用,當機體受到外界刺激,機體內環(huán)境發(fā)生相應改變,為對抗這種刺激便會誘發(fā)內質網應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),然而過強的ERS就會造成細胞損傷引起凋亡。近幾年有不少學者研究ERS與年齡相關性白內障的發(fā)病機制相關。我們前期實驗驗證Smac高表達與晶狀體混濁有關,然而缺乏進一步研究和探討,本實驗主要分為兩個方面研究,一方面是探討Smac與年齡相關性白內障晶狀體混濁是否有關,另一方面是擬下調Smac表達后通過內質網應激途徑對人晶狀體上皮細胞產生的影響。目的1.探討Smac是否與白內障發(fā)生有關。2.研究Smac通過內質網應激途徑對人晶狀體上皮細胞的影響。方法1.于本院收集人晶狀體前囊膜組織,收集157例(169只眼)年齡相關性白內障患者的晶狀體前囊膜片及5例正常人(10只眼)捐獻的晶狀體前囊膜。白內障患者晶狀體的混濁類型根據Emery核硬度分級標準,檢測Smac在人類晶狀體前囊表達,并采用HE染色和免疫組化半定量法分析Smac和白內障發(fā)生發(fā)展的關系。2.選取對數期細胞株,通過RNA干擾技術使Smac的表達下調。用H_2O_2誘導內質網應激,實驗分為四組:PBS組、H_2O_2組、siRNA-NC+H_2O_2組,siRNA-Smac+H_2O_2組。3.轉染進行24h后采用蛋白印跡法(Western blot)篩選出最佳干擾質粒。4.CCK-8法(Cell Counting Kit-8)篩選出合適的H_2O_2濃度誘導細胞凋亡率接近50%,并檢測下調Smac的表達后對人晶狀體上皮細胞活力的影響。5.轉染進行24-36h后,運用Annexin V-APC/PI法檢測PBS組、H_2O_2組、siRNA-NC+H_2O_2組,siRNA-Smac+H_2O_2組的細胞凋亡率。6.逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR,RT-PCR)檢測各組GRP78、CHOP、BAX/Bcl-2及caspase-3在m RNA水平的表達情況。7.Western Blot檢測GRP78,CHOP,Bax/Bcl-2及cleaved caspase-3檢測蛋白的表達情況。結果1.免疫組化半定量結果表明,ARC患者的前囊膜中Smac的表達高于正常人對照組,輕度和中度白內障患者中Smac的表達與晶狀體混濁沒有統計學差異,重度和全白的白內障患者中晶狀體混濁程度越重,Smac表達的陽性率越高。2.篩選出最佳干擾質粒為siRNA-Smac3,能夠有效下調Smac的表達。3.CCK-8法檢測出細胞凋亡率接近50%的H_2O_2的濃度為200μmol/L,作用時長為24h,下調Smac可增加LECs的細胞活力。4.流式細胞儀檢測各組凋亡率依次為PBS組(1.7±1.2)%、H_2O_2組(40.1±3.9)%、siRNA-NC+H_2O_2組(45.3±4.4)%,siRNA-Smac+H_2O_2組的凋亡率(26.5±2.8)%,與H_2O_2組相比,Smac的下調能夠使凋亡率下降(P0.05)5.RT-PCR檢測出siRNA-Smac+H_2O_2組比較H_2O_2組中的GRP78、CHOP、caspase-3及BAXm RNA表達減弱,Bcl-2在m RNA水平表達上調。6.Western blot檢測各組細胞結果顯示Smac下調后GRP78、CHOP、cleaved caspase-3、Bax蛋白水平的表達下降,Bcl-2相應增多。結論Smac與年齡相關性白內障密切相關,下調Smac的表達能夠抑制內質網應激途徑阻止人晶狀體上皮細胞的凋亡。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R776.1

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