本文關(guān)鍵詞： 外傷性視神經(jīng)病變 Rho激酶抑制劑 Rho/ROCK信號通路　出處：《新疆醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:外傷性視神經(jīng)損傷是顱腦、面部和眼眶外傷的嚴重并發(fā)癥,損傷后視力減弱或視野出現(xiàn)缺失,嚴重的甚至出現(xiàn)永久性視力障礙。然而視神經(jīng)損傷后干預治療的基礎(chǔ)層面研究,卻存在爭議。視神經(jīng)損傷后可能存在某種因素抑制神經(jīng)軸突的修復和再生。最新研究表明,中樞神經(jīng)受損后,存在有Rho/ROCK信號通路主導的抑制軸突修復和再生的抑制性環(huán)境。本研究旨在通過構(gòu)建兔外傷性視神經(jīng)鉗夾損傷模型,采取隨機對照實驗,分析Rho激酶及其下游分子的表達情況。同時應(yīng)用Rho激酶抑制劑法舒地爾,抑制Rho/ROCK信號通路,研究Rho激酶抑制劑對受傷視神經(jīng)軸突的保護和促進其軸突功能恢復的作用。通過常規(guī)病理、電鏡等方法考察視神經(jīng)損傷用藥后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、瞳孔變化,從而研究視神經(jīng)微血管及超微結(jié)構(gòu)病理變化及潰變過程,了解Rho激酶抑制劑干預措施對視神經(jīng)損傷后微血管的病理改變。此外,考察視神經(jīng)損傷用藥后Rho激酶及其下游分子表達水平的變化,確定誘導RGCs繼發(fā)性變性的初始因子,闡明其發(fā)生凋亡的機制。最終評估Rho激酶抑制劑對兔外傷性視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜、視神經(jīng)組織形態(tài)學的影響及軸突修復和再生微環(huán)境的影響,探討其對視神經(jīng)損傷的保護機制。方法:成年健康新西蘭白兔150只,按隨機數(shù)字表法,隨機選取6只未建模兔子為正常對照組(未損傷視神經(jīng));其余144只建立兔外傷性右側(cè)視神經(jīng)鉗夾損傷模型,根據(jù)藥物干預的不同將建模成功的144只新西蘭兔隨機分為3組,每組48只,分別為Rho激酶抑制劑組、地塞米松組及生理鹽水組。分別在損傷后3、7、14、21天摘取眼球制作石蠟切片和超微切片,石蠟切片進行蘇木素-伊紅染色、TUNEL染色,超微切片通過檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后進行電鏡觀察,分析比較損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)形態(tài)學變化;通過對石蠟切片進行免疫組化染色,檢測Caspase-3、Bcl-2、Crmp-2、Rho-A、ROCK1、ROCK2、Nogo-A的陽性表達水平;每個時間點每種分析各取3~6只兔子樣本,分離視神經(jīng)和視網(wǎng)膜,通過RT-PCR檢測RhoA、ROCK1、ROCK2、MLC、NOGO-A及GAP-43基因mRNA的相對表達量,比較模型建立后Rho激酶與下游分子的表達情況。此外,通過Western-Blot檢測GAP-43、Nogo-A、p-MLC、MLC及Caspase-3蛋白表達量,進一步驗證Rho/ROCK信號通路各因子的表達水平。結(jié)果:(1)組織形態(tài)學光鏡觀察:采用HE染色法,視神經(jīng)損傷后光鏡下觀察,早期視網(wǎng)膜出現(xiàn)腫脹,各層厚度較正常略增厚,細胞排列疏松而紊亂,僅見視網(wǎng)膜毛細血管擴張,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞少量減少。視網(wǎng)膜HE染色組織形態(tài)學觀察,正常組視網(wǎng)膜形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,分層整齊,層次清晰,RGCs呈單層排列,整齊密集,胞核清楚,核膜光滑完整。但是隨時間推移,各損傷時間節(jié)點損傷病理改變明顯,呈進行性加重。視神經(jīng)損傷3天組,視網(wǎng)膜形態(tài)改變,分層稍紊亂,細胞輕度水腫,層厚稍變厚,節(jié)細胞減少,視網(wǎng)膜內(nèi)核層細胞數(shù)目稍有減少,內(nèi)核層出現(xiàn)水腫。視神經(jīng)損傷7天組,視網(wǎng)膜分層結(jié)構(gòu)紊亂,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞核深染,細胞間隙增大,大量節(jié)細胞空泡變性,數(shù)目減少,有少量核固縮,染色加深,內(nèi)核層和外核層細胞明顯減少。視神經(jīng)損傷14天組視網(wǎng)膜形態(tài)改變,較前一組加重,視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)分層紊亂,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞固縮,大量減少,內(nèi)核層、外核層細胞大量缺失,外核層、外網(wǎng)層受到一定程度的破壞。視神經(jīng)損傷21天組,視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)分層紊亂,水腫改變較之前有所減輕,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞明顯固縮,大量減少,核深染,各層結(jié)構(gòu)紊亂,視網(wǎng)膜全層變薄。(2)視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察:正常組視神經(jīng)主要由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的軸突及周圍髓鞘、間質(zhì)內(nèi)的視神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成,大量軸突排列整齊,橫切面類圓形,包繞髓鞘。髓鞘致密,呈細板層樣結(jié)構(gòu),呈致密板層排列,軸突內(nèi)布滿微管、微絲,并可見線粒體等細胞器。視神經(jīng)損傷3天組視神經(jīng)軸突腫脹明顯,軸突數(shù)目減少,部分軸突髓樣變性,軸突內(nèi)微管微絲扭曲、排列稀疏。線粒體腫脹,嵴變短,消失,線粒體空泡樣變,髓鞘厚度變薄,板層結(jié)構(gòu)分離;視神經(jīng)損傷7天組,髓鞘松解,髓鞘普遍變性,洋蔥樣小體形成,厚度增加,板層結(jié)構(gòu)分離成多層,個別表現(xiàn)為脫髓鞘。膠質(zhì)細胞增生明顯,仍殘留有水腫軟化小區(qū),膠質(zhì)細胞腫脹,線粒體空泡變,部分神經(jīng)軸漿空泡變;視神經(jīng)損傷14天組,視神經(jīng)軸突空泡樣結(jié)構(gòu)多見,微管微絲溶解消失。板層結(jié)構(gòu)分離,神經(jīng)間質(zhì)基質(zhì)密度降低;視神經(jīng)損傷21天組,神經(jīng)變性,神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不規(guī)則,髓鞘結(jié)構(gòu)明顯紊亂,可見鞘膜泡狀解離,髓鞘明顯減少,微絲溶解,部分纖維軸漿空泡變,水腫軟化灶消失,軸突內(nèi)有大量雜質(zhì)填充(膠質(zhì)細胞胞突多見),可見小簇狀分布小髓鞘,旁邊可見些腫脹的髓鞘。地塞米松組與鹽水組比較,線粒體腫脹較輕,而法舒地爾組板層分離較少,視神經(jīng)損傷修復稍好,軸突枝芽較對照組多一些。(3)免疫組化觀察:外傷性視神經(jīng)損傷后,視網(wǎng)膜和視神經(jīng)表達的Rho A和ROCK蛋白水平明顯增強,而用Rho激酶抑制劑法舒地爾處理能夠顯著降低視網(wǎng)膜及視神經(jīng)Rho A和ROCK蛋白的表達。地塞米松組和Rho激酶抑制劑法舒地爾組均能夠明顯降低視神經(jīng)損傷后Rho/ROCK信號通路下游分子Crmp2在視神經(jīng)的表達,而且法舒地爾處理后降低效果更加明顯。視神經(jīng)損傷后,免疫組化結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達逐漸升高,抗凋亡蛋白Bcl2表達逐漸降低。(4)分子生物實驗(RT-PCR及Western-Blot)檢測:鹽水組的視網(wǎng)膜ROCK2基因相對表達量在14天時升高;RHO激酶抑制劑組的視網(wǎng)膜ROCK2基因相對表達量在14天時與3天組、7天組、21天組都有統(tǒng)計學差異(P0.05),RHO抑制劑組的視網(wǎng)膜ROCK2基因相對表達量在14天時低于鹽水組和地塞米松組;其它因子的檢測結(jié)果相類似。RT-PCR實驗結(jié)果顯示視神經(jīng)損傷后Nogo-A的相對表達量隨著時間的增加表達量上升,第14天達到峰值。而GAP-43的相對表達量與造模時間同樣呈正相關(guān),峰值出現(xiàn)在第7天。Western Blot結(jié)果表明在蛋白水平表達趨勢類似。結(jié)論:本研究利用臨時動脈瘤夾鉗夾新西蘭兔視神經(jīng)建模,成功構(gòu)建了視神經(jīng)損傷動物模型,其表現(xiàn)與臨床外傷性視神經(jīng)病變進程較類似。視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的形態(tài)學明顯改變,凋亡率顯著增加。視神經(jīng)損傷后,Rho/Rock信號通路被激活,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Rho A、ROCK1、ROCK2分子表達上調(diào),提示此信號通路在視神經(jīng)損傷后發(fā)揮重要功能。Rho激酶抑制劑法舒地爾在外傷性視神經(jīng)病變模型中,通過抑制Rho A激酶及其下游分子的表達,從而抑制Rho/ROCK信號通路,對外傷性視神經(jīng)病變有較為明顯的保護作用,其效果可能要好于地塞米松。另外RT-PCR及Western-Blot分析結(jié)果表明Nogo-A、GAP-43基因共同參與視神經(jīng)損傷后軸突的修復與再生進程。Rho激酶抑制劑可抑制Nogo-A基因的表達,促進GAP-43表達水平上調(diào)。本研究結(jié)果為以Rho-Rock信號通路為靶點治療視神經(jīng)損傷的分子生物學機制研究及藥物研發(fā)提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R774.6

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