本文關鍵詞： 自噬 凋亡 上皮細胞 IFN-γ 鼻息肉 p62　出處：《華中科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景：自噬是細胞內通過溶酶體途徑吞噬、降解老化的細胞器或入侵的細菌,病毒等,在細胞的生長,分化,抵御外界刺激,質量平衡方面發(fā)揮著重要的作用。但是如果自噬不足或自噬障礙則與疾病的發(fā)生密切相關。此外,目前自噬狀態(tài)或改變在慢性鼻鼻竇炎伴鼻息肉的疾病中研究的很少。研究目的：研究自噬流相關蛋白在慢性慢性鼻鼻竇炎伴鼻息肉中定位及表達,以及其與上皮細胞凋亡的研究。研究方法：(1)免疫組化及免疫印記方法(western blot; WB)檢測慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織及上皮細胞中自噬及凋亡相關蛋白表達：與自噬相關的蛋白包括：微管相關蛋白1的輕鏈3β-Ⅱ (microtubule-associated protein 1 light chain 3B (LC3B)-Ⅱ),白噬相關蛋白3,5,7(autophagy-related protein (Atg)3, Atg5, Atg7);B淋巴細胞-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting protein; Beclin 1);底物蛋白p62蛋白,泛素化蛋白(ubiquitinated protein);溶酶體標志物：溶酶體相關膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein 1; LAMP-1)凋亡相關蛋白包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3,-8(cysteine-aspartic protease (caspase)-3; caspase-8);聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase; PARP)(2)電鏡觀察慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織及上皮細胞自噬體及自噬溶酶體數量的改變。(3) western blot檢測慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細胞中自噬流的變化：分別用自噬抑制劑巴弗洛霉素Al (bafilomycin A1; Baf A1)和自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin;Rapa)來刺激慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細胞,觀察自噬流(LC3B,p62)及凋亡(cleaved PARP)的改變。(6) western blot檢測siNS或sip62后慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細胞中凋亡的改變：用20 nMsiNS或sip62轉染鼻息肉上皮細胞,48小時后觀察p62,caspase-8, caspase-3的表達變化。(7)刺激BEAS-2B細胞系篩選引起鼻息肉上皮細胞中自噬不足的上游因子：分別用白介素(interleukin (IL)-4,-13,-17A)或干擾素-γ(interferon-gamma; IFN-γ)或聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid; poly(I:C); dsRNA),or脂多糖(lipopolysaccharides; LPS)刺激BEAS-2B細胞系,western blot觀察LC3B,p62,ubiquitinated proteins,及凋亡的改變。(8)篩選出的INF-γ刺激正常鼻粘膜上皮細胞(nasal epithelial cells; NECs)觀察自噬和凋亡的改變：用IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮細胞(NECs),通過western blot檢測觀察LC3B,p62,ubiquitinated proteins的表達,western blot及Anexin V/PI觀察凋亡的改變。(9) IFN-γ刺激后WB檢測正常鼻粘膜上皮細胞中自噬流的變化：用rapamycin預先處理上皮細胞3小時后,再用IFN-γ刺激,或先IFN-γ刺激上皮細胞24小時,于收集細胞前加入bafilomycin Al刺激3小時,western blot檢測自噬流(LC3B,p62)及cleaved PARP的改變；Anexin V/PI檢測凋亡的改變。(10)轉染siNS或sip62,siAtg5到正常鼻粘膜上皮細胞,再IFN-y刺激后觀察p62及凋亡的改變：轉染20 nM siNS或sip62,或60 nMsiAtg5到正常鼻粘膜上皮細胞后,再IFN-y刺激24小時,觀察p62蛋白及凋亡的改變。研究結果：(1)自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ,Atg3,Atg5,Atg7,Beclin 1;自噬底物蛋白p62,ubiquitinated蛋白；溶酶體標記物LAMP-1,以及凋亡相關蛋白cleaved caspase-8, caspase-3 and PARP在嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎的組織,及鼻粘膜上皮細胞中,相較于正常組,均表達增加。(2)加入自噬抑制劑bafilomycin A1引起鼻息肉上皮細胞中LC3B-Ⅱ, p62, cleaved PARP的蛋白表達水平均升高,而加入自噬激動劑rapamycin僅引起LC3B-Ⅱ輕微升高,p62, cleaved PARP相應的出現輕微的降低,均相對于對照組無統(tǒng)計學意義,提示在鼻息肉上皮細胞中自噬是升高的,而且自噬流的通路是無障礙的。(3)用轉染技術轉染sip62到鼻息肉上皮細胞中,我們觀察到相應的外源性的凋亡通路cleaved caspase 8, cleaved PARP的蛋白水平均出現降低。(4)分別用白介素IL-4,IL-13,IL-17A或IFN-γ或dsRNA,或LPS刺激BEAS-2B細胞系,篩選出INF-γ可能是鼻息肉上皮細胞中自噬不足的上游影響因素。再用INF-γ刺激氣液界面培養(yǎng)的正常原代鼻黏膜上皮細胞,我們發(fā)現與刺激BEAS-2B細胞系的結果類似,自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ出現增高；而其底物蛋白p62, ubiquitinated蛋白反而也出現增高。為進一步證實是否存在白噬不足,我們再次加入自噬抑制劑bafilomycin A1到INF-γ刺激的正常鼻粘膜上皮細胞,發(fā)現上皮細胞中LC3B-Ⅱ, p62, cleaved PARP的蛋白表達水平均升高,而加入白噬激動劑rapamycin僅引起LC3B-II輕微升高,p62,cleaved PARP相應的出現輕微的降低,均相對于對照組無統(tǒng)計學意義,IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮細胞與鼻息肉上皮細胞出現的自噬不足的狀態(tài)類似。(5)為進一步證實IFN-γ通過p62蛋白誘導上皮細胞凋亡,我們分別sip62或siAtg5到正常鼻粘膜原代上皮細胞,再用IFN-γ刺激。我們發(fā)現sip62+IFN-γ相較于siNS+IFN-γ,cleaved PARP及capase-8的表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義；而siAtg5后p62表達上調,所以siAtg5+IFN-γ相較于siNS+IFN-γ,cleaved PARP及capase-8的表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義。所以在鼻粘膜上皮細胞中IFN-γ可能通過p62蛋白影響上皮細胞凋亡。研究結論：lIFN-γ在嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎組織中均表達增高。而且凋亡在嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎上皮細胞中均表達增高。2.增高的IFN-γ可能通過誘導自噬不足引起p62蛋白的上調,進而通過增高的p62蛋白激活外源性的凋亡通路,引起慢性鼻-鼻竇炎上皮細胞的凋亡。臨床意義：臨床上,我們可以使用抗IFN-γ及抗p62的藥物,從而來改善自噬不足及上皮細胞的凋亡,減輕嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎中粘膜屏障功能的損傷。內容概要：在嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎上皮細胞中存在自噬不足的情況,表現為LC3B-Ⅱ增高,而其底物蛋白p62也同時增高。這種自噬不足可能由于細胞因子IFN-γ的作用,而且IFN-γ可通過自噬不足引起的p62蛋白的增高,誘導鼻粘膜上皮細胞凋亡。
[Abstract]:Objective : To study the role of autophagy - related protein in chronic sinusitis complicated with nasal polyps . The changes of autophagy and autophagy in nasal polyps and nasal polyps were observed by electron microscopy . ( 3 ) The changes of autophagy in nasal polyps were detected by western blot . ( 7 ) To stimulate BEAS - 2B cell lines to screen the upstream factors which caused insufficient autophagy in nasal polyp epithelial cells : interleukin ( IL ) -4 , -13 , - 17A or polyinosinic acid ; poly ( I : C ) ; dsRNA ) , or lipopolysaccharide ( IFN - 緯 ) or poly ( I : C ) ; dsRNA ) , or lipopolysaccharide ( lipopolysaccharides ; LPS ) to stimulate BEAS - 2B cell line . (9) IFN-緯鍒烘縺鍚嶹B媯，

本文編號：1500577