本文關(guān)鍵詞：間歇性低氧微環(huán)境下自噬調(diào)控頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞功能及其相關(guān)機(jī)制的研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive sleep apnea hyponea syndrome,OSAHS)是一種普遍的睡眠相關(guān)呼吸疾病,主要表現(xiàn)為睡眠期間上呼吸道的反復(fù)性阻塞和機(jī)體通氣障礙。作為OSAHS患者最具代表性的病理學(xué)體征,間歇性低氧(Intermittent hypoxia,IH)常引發(fā)低氧血癥,高碳酸血癥等一系列不良后果,是機(jī)體代謝性障礙及心血管疾病的潛在高危因素。有研究證實(shí),上呼吸道擴(kuò)張肌,尤其是頦舌肌功能異常是OSAHS的重要致病誘因,而IH又進(jìn)一步加重了頦舌肌功能損傷。眾所周知,肌衛(wèi)星細(xì)胞(Muscle satellite cells,Mu SCs)是參與骨骼肌損傷修復(fù)的主力。然而,長期患有OSAHS的人群卻仍難以逆轉(zhuǎn)頦舌肌纖維類型改變及功能異常的情況。因此,我們推測(cè),是否IH對(duì)頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)生了異常影響,從而降低了其修復(fù)能力。另一方面,作為目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),自噬與眾多涉及低氧的疾病緊密相關(guān)。低氧可誘發(fā)自噬。自噬通常被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。那么自噬與IH導(dǎo)致的頦舌肌功能異常之間是否存在某種相關(guān)性呢?為了弄清這一問題,我們?cè)噲D通過研究IH環(huán)境下頦舌肌Mu SCs的自噬活性變化以及自噬對(duì)頦舌肌Mu SCs相關(guān)功能的影響,從而為深入探索OSAHS發(fā)病機(jī)制并研發(fā)針對(duì)頦舌肌功能異常的治療方法提供新的思路。方法1.應(yīng)用改良式間歇性低氧艙建立間歇性低氧大鼠模型,并通過血?dú)夥治龇ㄔu(píng)估建模成效。2.通過透射電鏡、HE染色、免疫組織化學(xué)染色以及免疫組織熒光染色等方法觀察IH環(huán)境下頦舌肌的組織病理學(xué)變化。3.采用酶消化法與差速貼壁純化法進(jìn)行大鼠頦舌肌Mu SCs原代培養(yǎng);通過MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長曲線;利用免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞種屬。4.分別通過成肌、成脂、成骨誘導(dǎo)法檢驗(yàn)頦舌肌Mu SCs的多向分化潛能。5.采用三氣培養(yǎng)箱模擬IH環(huán)境,建立頦舌肌Mu SCs間歇性低氧模型,通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同IH時(shí)間下頦舌肌Mu SCs中自噬與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,初步探討IH環(huán)境下自噬與凋亡的相關(guān)性。從中選出自噬活性峰值時(shí)間點(diǎn),并以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)J(rèn)IH處理時(shí)間。6.采用MTT比色法、蛋白質(zhì)印跡法以及吖啶橙染色法共同篩選自噬抑制劑氯喹的適宜用藥濃度,并以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)J(rèn)用藥劑量,從而在IH環(huán)境下建立具有不同自噬活性的頦舌肌Mu SCs模型。7.通過蛋白質(zhì)印跡法與流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)不同自噬活性下頦舌肌Mu SCs中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及細(xì)胞凋亡率。8.通過透射電鏡觀察不同自噬活性下頦舌肌Mu SCs中線粒體超微結(jié)構(gòu);采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位。9.使用激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同自噬活性下頦舌肌Mu SCs的鈣離子水平。結(jié)果1.血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示,IH組大鼠的血氧飽和度和血氧分壓較對(duì)照組明顯下降,提示間歇性低氧大鼠模型建立成功。2.HE染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IH組大鼠頦舌肌纖維明顯肥大,形態(tài)改變,肌纖維間距狹窄。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IH組大鼠頦舌肌中線粒體明顯腫脹,邊界不清,結(jié)構(gòu)異常。免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IH組大鼠頦舌肌中細(xì)胞色素c表達(dá)顯著增加。免疫組織熒光染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IH組大鼠頦舌肌中LC3熒光表達(dá)明顯上調(diào)。3.免疫熒光結(jié)果顯示:Pax 7蛋白染色陽性,且陽染率達(dá)95%以上,說明該細(xì)胞符合實(shí)驗(yàn)要求,可用于后續(xù)研究。4.經(jīng)多向分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示,頦舌肌Mu SCs能夠分化形成肌管、脂滴以及骨性礦化結(jié)節(jié)。5.蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IH環(huán)境下的頦舌肌Mu SCs自噬蛋白表達(dá)量普遍增加,在6h左右達(dá)到峰值,12h左右下降;同時(shí),凋亡蛋白表達(dá)量也明顯增加,但在1、3、6h之間的蛋白表達(dá)量差異不明顯,隨著時(shí)間推移,其在12、24h的表達(dá)量顯著遞增。依實(shí)驗(yàn)所需,后續(xù)實(shí)驗(yàn)以自噬活性峰值點(diǎn)6h作為默認(rèn)IH時(shí)間。6.經(jīng)MTT比色法、蛋白質(zhì)印跡法及吖啶橙染色法共同篩選得出,自噬抑制劑氯喹的適宜用藥濃度為25μmol/L,且在該濃度下氯喹能夠有效抑制IH誘發(fā)的自噬。7.蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IH組Cyt c、caspase 3蛋白表達(dá)明顯增加;與IH組相比,IH+氯喹組Cyt c、caspase 3蛋白表達(dá)顯著提高。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,細(xì)胞凋亡率依次為:IH+氯喹組IH組對(duì)照組。各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8.透射電鏡觀察結(jié)果顯示:對(duì)照組線粒體未見明顯異常。IH組線粒體肥大腫脹。IH+氯喹組中線粒體皺縮。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,線粒體膜電位高低依次為:對(duì)照組IH組IH+氯喹組,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。9.激光共聚焦動(dòng)態(tài)觀測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)鈣離子基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度依次為:IH+氯喹組IH組對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入KCL刺激后,對(duì)照組細(xì)胞鈣瞬變迅速;與對(duì)照組相比,IH組細(xì)胞鈣瞬變速率降低;與IH組相比,IH+氯喹組細(xì)胞鈣瞬變遲鈍,隨后突發(fā)熒光異常淬滅。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.成功建立間歇性低氧大鼠模型。2.IH能夠引起頦舌肌組織損傷,同時(shí)觸發(fā)自噬。3.成功建立了頦舌肌Mu SCs的體外研究模型,且細(xì)胞純度高。4.IH能夠誘發(fā)頦舌肌Mu SCs的自噬與凋亡。5.適量氯喹能夠有效抑制IH環(huán)境下頦舌肌Mu SCs的自噬活性。6.在IH環(huán)境下抑制自噬活性會(huì)增加頦舌肌Mu SCs凋亡率,提示自噬可能具有抑制細(xì)胞凋亡,應(yīng)對(duì)IH損傷的保護(hù)性機(jī)制。7.在IH環(huán)境下抑制自噬活性會(huì)引起頦舌肌Mu SCs線粒體及細(xì)胞功能損傷,提示自噬可能通過影響線粒體功能從而保護(hù)細(xì)胞以抵御損傷,減少凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R766

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10 李勤;李，

本文編號(hào)：1421447