本文關(guān)鍵詞：人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的：1.觀察hESC向視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞分化過程中的形態(tài)學(xué)變化,通過比較不同的培養(yǎng)方法探討最優(yōu)的分化培養(yǎng)策略。2.檢測hESC向視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞分化過程中Ki67、SSEA4、Otx2、Sox2、 Rhodopsion等基因在不同培養(yǎng)時(shí)期的表達(dá)規(guī)律。方法：1.采用貼壁培養(yǎng)加懸浮培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)hESC H1細(xì)胞系向視網(wǎng)膜前體細(xì)胞分化,并通過免疫熒光染色的方法觀察hESC定向誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞培養(yǎng)第0、第10、第20、第30天不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)和增殖周期的特性;2.通過Western Blot、qRT-PCR等方法檢測hESC定向誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞培養(yǎng)第0、第10、第20、第30天不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)水平和相應(yīng)蛋白的變化。結(jié)果：1.H1細(xì)胞在Matrigel膠上6小時(shí)左右即可貼壁,貼壁后細(xì)胞由圓形逐漸伸出偽足向四周延展,胞體呈長梭形,光鏡下胞體透亮,折光性較強(qiáng),核分裂像明顯,細(xì)胞生長2-3天后相鄰細(xì)胞集落逐漸融合,細(xì)胞呈網(wǎng)狀聚集,細(xì)胞融合度在培養(yǎng)2-3天時(shí)可達(dá)80-90%左右。2.H1細(xì)胞在擬胚體培養(yǎng)基中生長1天后散在的細(xì)胞即可聚集成球狀細(xì)胞團(tuán),根據(jù)細(xì)胞數(shù)目不同細(xì)胞團(tuán)的直徑也不盡相同,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞團(tuán)直徑略有增長,在光鏡下觀察可見擬胚體細(xì)胞團(tuán)中間稍暗周邊透亮,細(xì)胞失去貼壁時(shí)的長梭行態(tài)并互相緊密貼合在擬胚體細(xì)胞團(tuán)塊內(nèi)。3.擬胚體在視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞分化培養(yǎng)基中第一天即可貼附于孔底,細(xì)胞團(tuán)中間密度較大細(xì)胞緊密排列,周圍密度較小可見細(xì)胞爬出,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞團(tuán)周圍逐漸有類圓形細(xì)胞爬出,初始時(shí)細(xì)胞體積較小,排列擁擠,在向四周延展的同時(shí),細(xì)胞逐漸變大,細(xì)胞形態(tài)由原來的類圓形變?yōu)殚L梭形,在第10天左右形成玫瑰花結(jié)形狀,細(xì)胞形態(tài)隨著時(shí)間的延長細(xì)胞軸突逐漸增多伸長,與神經(jīng)細(xì)胞類似。4.細(xì)胞免疫熒光、Western Blot、qRT-PCR等方法結(jié)果顯示hESC定向誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞過程中,第0、10、20、30天時(shí)Otx2和S0x2二者始終陽性表達(dá);SSEA4表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長減少;Ki67表達(dá)量逐漸減少;Rhodopsin始終不表達(dá)。結(jié)論：改良SFEB/DLFA分化方法,即在擬胚體培養(yǎng)和視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞分化培養(yǎng)基中分別添加B-27、Noggin、Dkk-1以及IGF-1等細(xì)胞因子可使胚胎干細(xì)胞在自身基因調(diào)控與分化培養(yǎng)基共同作用下,在無血清無feeder條件下高效向視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞分化。視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞分化培養(yǎng)過程中細(xì)胞的分裂增殖能力逐漸降低,D30時(shí)仍然具有部分干細(xì)胞分化增殖能力,SSEA-4表達(dá)量減少,表示細(xì)胞逐漸分化成熟,Otx2基因與Sox2基因作為眼發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子、視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的重要標(biāo)記物在視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞分化中高表達(dá),但尚未發(fā)育為成熟的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1
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本文編號：1304978