本文關(guān)鍵詞：甲酰基肽受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移在脊髓損傷中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： BV-2細(xì)胞 Fpr1 fMLP Boc-MLF 遷移 ERK信號(hào)通路

【摘要】：脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)是脊柱外科常見的嚴(yán)重疾病之一,發(fā)病率逐年增加,發(fā)病原因主要包括運(yùn)動(dòng)傷、跌倒、交通事故和暴力傷害等所致。SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)很差,常引起脊髓損傷節(jié)段以下的肢體嚴(yán)重的功能障礙,嚴(yán)重影響患者的神經(jīng)功能和生活質(zhì)量。SCI的高發(fā)人群為中青年,該年齡段是社會(huì)的主要?jiǎng)趧?dòng)力,往往給其家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床治療脊髓損傷的主要方法是通過使用甲強(qiáng)龍減輕損傷后炎癥的發(fā)生和發(fā)展,預(yù)防二次損傷以及防治細(xì)胞變性和壞死。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,過度的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的主要原因,不良的炎性微環(huán)境是限制神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。但是,SCI后局部的保護(hù)性免疫反應(yīng)亦能清除局部組織碎片和毒性代謝產(chǎn)物,為SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)提供良好的微環(huán)境,能夠促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的再生。因此,免疫反應(yīng)在SCI的病理生理過程中起著雙刃劍的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的固有免疫細(xì)胞,是CNS最重要的免疫防線。作為炎癥細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷后局部的聚集和吞噬功能,對(duì)于SCI預(yù)后有重要的影響。小膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的定向遷移,是通過G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptor,GPCR)與病原體或自身來源的趨化因子結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。如何調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移是研究的關(guān)鍵,而甲�；氖荏w(Formyl-peptide Receptors,FPRs)是GPCR家族成員之一,是具有趨化炎癥細(xì)胞遷移功能的受體。因此,FPRs在小膠質(zhì)細(xì)胞遷移中是否作用,是否能夠促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)?本研究以Fpr1(Formyl-peptide receptor 1,Fpr1)和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞為切入點(diǎn),通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)BV-2細(xì)胞能夠表達(dá)Fpr1,而Fpr1能夠特異性地介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。同時(shí),Fpr1特異性激動(dòng)劑fMLP(formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine,fMLP)可上調(diào)BV-2細(xì)胞中Fpr1表達(dá)水平,以及該作用是通過活化ERK(Extracellular Regulated Protein Kinases,ERK)信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。材料與方法1.小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞的培養(yǎng)及Fpr1表達(dá)鑒定將小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞在含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的改良型RMPI1640培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。待BV-2細(xì)胞不斷增殖且鋪滿培養(yǎng)瓶底部時(shí),用胰酶消化懸浮和離心后,分瓶進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。為了明確小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞Fpr1的表達(dá),在激光共聚焦培養(yǎng)皿中接種BV-2細(xì)胞后進(jìn)行Fpr1的免疫熒光(Immunofluorescence,IF)染色鑒定。2.fMLP對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的影響為了確定Fpr1對(duì)于小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞遷移的影響,將培養(yǎng)的BV-2細(xì)胞消化、離心和計(jì)數(shù)后,按加入不同濃度的fMLP分為6組,0 nmol/L對(duì)照組,1 nmol/L組、10 nmol/L組、50 nmol/L組、100 nmol/L組、500 nmol/L組,接種于Transwell小室干預(yù)48h后,采用結(jié)晶紫染色法觀察Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的影響。3.Fpr1受體在BV-2細(xì)胞遷移中的作用為了明確Fpr1在BV-2細(xì)胞遷移中作用,我們采用Transwell法,把BV-2細(xì)胞隨即分為對(duì)照組、100nmol/L fMLP激動(dòng)劑組、5μmol/L Boc-MLF(Boc-peptides N-formyl-Met-Leu-Phe)阻斷劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑+100nmol/L fMLP激動(dòng)劑組,其中Fpr1特異性阻斷劑Boc-MLF干預(yù)20 min后,觀察Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的特異性作用,并且明確其作用是否能被Fpr1特異性阻斷劑所抑制。4.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fpr1對(duì)BV-2細(xì)胞遷移的作用為了進(jìn)一步驗(yàn)證和明確Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的作用,采用劃痕實(shí)驗(yàn),把BV-2細(xì)胞同樣分為對(duì)照組、100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組,來確定Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移作用的特異性。5.fMLP和Boc-MLF對(duì)于BV-2細(xì)胞中Fpr1蛋白表達(dá)的影響為了檢測(cè)fMLP和Boc-MLF對(duì)于BV-2細(xì)胞中Fpr1蛋白表達(dá)量的影響,將BV-2細(xì)胞按不同干預(yù)因素處理,分對(duì)照組、100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組,用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Fpr1蛋白的表達(dá)水平變化。6.ERK信號(hào)通路在Fpr1調(diào)節(jié)BV-2細(xì)胞遷移中的作用為了探尋Fpr1在調(diào)節(jié)BV-2細(xì)胞遷移中可能的分子機(jī)制,按不同干預(yù)因素處理,分對(duì)照組、100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組,分別處理20 min后,采用Western blot法檢測(cè)各組ERK蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞表達(dá)Fpr1使用倒置相差顯微鏡觀察BV-2細(xì)胞狀態(tài)顯示:BV-2細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),形態(tài)良好,輪廓清晰,培養(yǎng)基清澈。此外,免疫熒光染色結(jié)果顯示:小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2表達(dá)Fpr1陽性。2.Fpr1能夠誘發(fā)BV-2細(xì)胞的遷移Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:采用不同濃度的Fpr1特異性激動(dòng)劑fMLP(1nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L)分組進(jìn)行干預(yù)48 h后,使用倒置顯微鏡觀察,可見隨著fMLP濃度的增高,從Transwell上室穿透到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著高于空白對(duì)照組,且具有明顯的濃度依賴性,其中100 nmol/L組和500 nmol/L組效果最顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.Fpr1促進(jìn)BV-2細(xì)胞遷移作用具有特異性劃痕實(shí)現(xiàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,100 nmol/L的fMLP能夠顯著增強(qiáng)BV-2細(xì)胞的遷移能力,并且其促進(jìn)遷移的作用能被Boc-MLF所抑制。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Fpr1促進(jìn)BV-2細(xì)胞遷移的作用,再次采用Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn),其結(jié)果也顯示:100 nmol/L的fMLP能夠顯著增強(qiáng)BV-2細(xì)胞的遷移能力,并且其促進(jìn)遷移的效應(yīng)能被Boc-MLF所抑制,,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,共同表明了Fpr1受體在BV-2細(xì)胞遷移中具有重要的作用。4.fMLP可以上調(diào)BV-2細(xì)胞中Fpr1蛋白的表達(dá)量各組細(xì)胞經(jīng)上訴方法分別干預(yù)90 min后,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,fMLP組Fpr1蛋白表達(dá)水平顯著升高;Boc-MLF+fMLP組的Fpr1蛋白表達(dá)水平相比fMLP組則又降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明fMLP可以上調(diào)BV-2細(xì)胞Fpr1蛋白的表達(dá)水平。5.fMLP通過活化ERK信號(hào)通路促進(jìn)BV-2細(xì)胞的遷移各組細(xì)胞經(jīng)分別干預(yù)20 min后,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,fMLP組p-ERK蛋白表達(dá)水平較高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Boc-MLF+fMLP組的p-ERK蛋白表達(dá)水平相比fMLP組則又降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明fMLP可以上調(diào)BV-2細(xì)胞中p-ERK蛋白的表達(dá)水平,且能被Boc-MLF所抑制。此結(jié)果與結(jié)果4共同表明,fMLP通過上調(diào)BV-2細(xì)胞中Fpr1和p-ERK的表達(dá)而促進(jìn)了其遷移。結(jié)論1.Fpr1能夠特異性趨化小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。2.ERK信號(hào)通路介導(dǎo)Fpr1趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。
【關(guān)鍵詞】：BV-2細(xì)胞 Fpr1 fMLP Boc-MLF 遷移 ERK信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2 細(xì)胞的培養(yǎng)與FPRs鑒定15-22
• 2.1 材料與方法15-19
• 2.2 結(jié)果19-20
• 2.3 討論20-21
• 2.4 小結(jié)21-22
• 第三章 Fpr1對(duì)于小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2 細(xì)胞遷移的影響22-31
• 3.1 材料與方法22-26
• 3.2 結(jié)果26-29
• 3.3 討論29-30
• 3.4 小結(jié)30-31
• 第四章 Fpr1促進(jìn)BV-2 細(xì)胞遷移的機(jī)制研究31-39
• 4.1 材料與方法31-34
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法34-35
• 4.3 結(jié)果35-37
• 4.4 討論37-39
• 全文總結(jié)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 文獻(xiàn)綜述 小膠質(zhì)細(xì)胞與甲�；氖荏w在脊髓損傷中的研究進(jìn)展45-56
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 碩士學(xué)習(xí)期間發(fā)表論文56-57
• 致謝57

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本文編號(hào)：966361