本文關鍵詞：絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料研究

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【摘要】：研究背景對于骨折的治療,經(jīng)歷了由堅強固定到生物學固定的過程。骨折治療理念的進步對骨內(nèi)植物提出了新的要求。傳統(tǒng)的釘板系統(tǒng)存在感染、應力遮擋、釘板移位以及主觀疼痛或感覺異常等問題。大約12%頜面部骨折患者術后需要二次手術拆除內(nèi)固定,隨著可吸收高分子聚合物材料研究的發(fā)展,如聚乙酸,聚羥基乙酸,聚乙酸乙醇酸可吸收接骨板和螺絲釘?shù)膽玫染山档投问中g的風險,并且可以逐漸把應力轉(zhuǎn)移到愈合的骨頭上從而促進骨再生。這些潛在的好處說明可吸收材料在治療骨折時的樂觀前景。但這些可吸收材料也存在觸感明顯,局部自限性炎癥反應,感染和內(nèi)固定需再次拆除等問題。絲素蛋白材料是美國FDA批準的,具有堅強的力學性能,良好的生物相容性的可降解生物材料,可以在超過170℃環(huán)境維持結構穩(wěn)定,可以被高溫高壓滅菌,在極端pH值下也很穩(wěn)定。根據(jù)既往文獻報道絲素蛋白材料具有成為制備新型的醫(yī)用可降解生物材料的良好潛能。但高強度的絲素蛋白材料制作過程包括各種化學試劑處理,通過溫度、濃度等實驗條件改變誘導絲素蛋白內(nèi)部分子結構的排布,如從無規(guī)蜷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結構等,從而提高材料的強度,材料加工過程中不可避免的會加入有害化學試劑如甲醇,六氟異丙醇等,因此加工工藝是否會導致有害物質(zhì)殘留,相關物理化學性能改變而影響其良好的生物相容性和力學性能仍需要進一步研究。研究目的本研究以制備高強度、可吸收且具有良好生物相容性的絲素骨科內(nèi)固定材料為目的,在文獻學習的基礎上摸索改進材料制備條件和工藝,詳細探討了新制備材料的基本性質(zhì),并從體外細胞形態(tài)觀察,細胞毒性,細胞增殖,細胞凋亡,血液相容性等角度初步評價了絲素骨科內(nèi)固定材料的體外生物相容性,為后期動物實驗及臨床應用提供依據(jù)。研究方法1.材料的制備：主要包括蠶絲脫膠、洗滌、干燥、蠶絲溶解、絲素混合溶液透析、溶液離心、冷凍凍干、再次溶解真空干燥的絲素纖維。絲素螺釘模具制作、甲醇置換、梯度換水、干燥、后期加工絲素螺釘及絲素固定板。2.材料的基本性質(zhì)：通過生物力學機器測定三點彎,剪切力及彈性模量數(shù)據(jù)；通過接觸角測量儀測定材料表面接觸角；通過掃描電鏡觀察材料表面及橫斷面的微觀結構,并用X線衍射儀及能譜分析儀檢測材料表面的主要成分及元素組成；通過pHS-2C數(shù)字式酸度計測定浸提液的pH值；通過計算平衡鹽溶液浸泡前后絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料重量的改變,材料直徑的變化評價吸水膨脹性能；通過計算體外蛋白酶ⅪⅤ處理下不同時間點材料重量改變評價降解性能；通過螺釘植入家兔股骨中評價絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料術中的可植入性能。3.生物相容性試驗：按照ISO 10993.12標準制備材料浸提液并培養(yǎng)細胞小鼠前成骨細胞,空白對照組采用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用鈣黃綠素死活細胞染色、細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量測定判斷有無細胞毒性,倒置顯微鏡觀察與材料共培養(yǎng)(或者與材料浸提液共培養(yǎng))的細胞形態(tài),CCK-8法檢測材料及其浸提液對細胞相對增殖率的影響,細胞凋亡實驗評價材料對細胞凋亡和壞死過程的影響,溶血試驗判斷材料對血液紅細胞有無溶血反應,根據(jù)上述結果綜合評價絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的生物安全性。研究結果1.材料的表征1.1 通過生物力學機器測定絲素圓柱棒最大剪切應力為42.6±13.5MPa。其抗彎強度達67.2±8.4MPa,彈性模量為8.1±1.1 GPa；與金屬材料相比其彈性模量更接近骨骼本身的彈性模量；通過植入家兔股骨試驗,共在12只家兔體內(nèi)植入24枚螺釘,均成功植入,后期觀察除了其中一只家兔右后腿跛行外,其余家兔行走均良好。前三個月標本取出后可見螺釘仍牢固固定在股骨干內(nèi),未發(fā)生脫出或移位等情況,材料與骨質(zhì)接觸表面良好,未見顏色改變等不良反應。1.2通過接觸角測量儀測定材料表面接觸角為95.8±8.5°,提示材料表面疏水。1.3電子掃描電鏡觀察材料表面均勻,結構致密。能譜分析儀結果提示該材料主要由碳、氮、氧、鈣組成,其中碳元素原子百分比約為62.81%,氮元素約占14.69%,氧元素約占22.40%,鈣元素約占0.1%。1.4絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料吸水膨脹性能：浸泡10min時材料重量已經(jīng)開始增加,并且在2h開始,吸水速度開始增快,并且最終在PBS中浸泡48h后基本達到飽和,其最大吸水率達30.7±0.3%,后期隨著浸泡時間延長,吸水率未發(fā)生明顯改變。材料吸水后直徑也隨著浸泡時間延長而不斷增加,其中直徑增長速度也是在浸泡2h后開始增加,并在浸泡48h時間點附近直徑增大最高達17.9±1.5%。1.5體外蛋白酶XIV降解試驗提示材料的降解曲線擬合符合二階函數(shù)規(guī)律,y=0.00087x2+0.2003x-0.495, R2=0.98,根據(jù)公式可以推導材料可在體外酶環(huán)境下降解3個月重量減少百分比為24.57%,體外完全降解需要8個月時間。1.6通過pHS-2C數(shù)字式酸度計測定浸提液的pH值可得到隨著浸泡時間的延長,其PH值未發(fā)生明顯波動趨勢,最終穩(wěn)定在7.0-7.2之間。2.材料的生物相容性2.1 細胞毒性試驗：絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料浸提液與MC3T3-E1細胞復合培養(yǎng)24h后,LDH活性測定,材料浸提液組與空白對照組分別為(963.0±90.0)U/L,(882.4±106.0)U/L,兩組數(shù)據(jù)之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)；鈣黃綠素死活細胞染色實驗(綠染為活細胞,紅染為死細胞)可見絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料周邊細胞生長狀態(tài)良好,細胞形體正常,鋪展良好,高倍鏡下可見細胞伸展性良好,未見明顯死細胞。以上結果提示材料無明顯細胞毒性。2.2 形態(tài)觀察：絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料及其浸提液分別與MC3T3-E1細胞復合培養(yǎng)48h后,倒置熒光顯微鏡下觀察材料及其浸提液培養(yǎng)的細胞貼壁良好,呈正常生長,形態(tài)呈梭形,胞漿內(nèi)可見少量離散的黑色顆粒,未見明顯細胞溶解等,符合0級標準。2.3 細胞增殖實驗：細胞與材料共培養(yǎng)實驗中,隨著培養(yǎng)時間的延長,各組OD值逐漸升高,雖然不同時間點材料共培養(yǎng)組的OD值均低于空白對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；而在細胞與材料浸提液共培養(yǎng)實驗中,隨著培養(yǎng)時間的延長,各組0D值逐漸升高,但實驗組與空白對照組的OD值基本相等,未見統(tǒng)計學差異(P0.05)；2.4 細胞凋亡實驗：絲素蛋白組壞死率為3.0%,凋亡率為2.3%；空白對照組壞死率為2.0%,凋亡率為2.9%；陽性對照組壞死率為3.5%,凋亡率為6.4%。材料共培養(yǎng)組與空白對照組的細胞凋亡率和壞死率沒有顯著性差異。說明絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料不會導致小鼠成骨細胞的凋亡或壞死。2.5 溶血實驗檢測絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的溶血率為1.9%,其溶血率符合可植入醫(yī)用材料的安全標準(5%)。結論1.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料具有良好的生物力學強度,且與臨床應用廣泛的金屬材料對比其彈性模量更接近骨骼本身的彈性模量,是一種新型的高強度可吸收生物材料,具有較大的臨床應用價值。2.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料吸水速率較慢,可滿足臨床醫(yī)生術中操作要求；降解周期長,具有為骨折愈合提供良好固定的潛力。3.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料表面具有疏水性,不利于細胞粘附；但材料周邊細胞生長正常,與材料或其浸提液共培養(yǎng)均未見明顯細胞毒性,材料不影響細胞增殖,對細胞凋亡未見明顯不良影響。4.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料溶血率低于5%,具有良好的血液相容性。因此本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料是一種生物相容性好,機械強度高,可緩慢生物降解,且降解產(chǎn)物不會對細胞機體產(chǎn)生不利影響的生物材料,具有容易植入,塑形良好,能在骨骼中保持8周以上的特征,所有這些特性都展示出其在生物醫(yī)療器械中的應用潛力。伴隨著以后制備工藝的改進,材料表面涂層的研究,抗菌性能的添加等進步,絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料有望替代現(xiàn)有的可吸收骨科內(nèi)固定材料而廣泛應用于臨床。
【關鍵詞】：絲素蛋白 骨科內(nèi)固定 生物可降解 生物相容性 生物力學
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R687
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 前言15-18
• 1.1 骨折治療觀念的轉(zhuǎn)變15-16
• 1.2 絲素蛋白材料的應用現(xiàn)狀16-17
• 1.3 本研究目的和主要內(nèi)容17-18
• 第二章 絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的制備及生物力學18-23
• 2.1 實驗材料18-19
• 2.2 實驗方法19-21
• 2.3 結果與討論21-23
• 第三章 絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的基本性質(zhì)23-33
• 3.1 材料與方法23-25
• 3.2 結果與討論25-30
• 3.3 小結30-33
• 第四章 絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的生物相容性33-51
• 4.1 材料與方法33-41
• 4.2 結果與討論41-47
• 4.3 材料對溶血實驗的影響47-48
• 4.4 小結48-51
• 第五章 結語51-53
• 5.1 全文結論51-52
• 5.2 展望52-53
• 參考文獻53-60
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文60-61
• 致謝61-63

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