本文關鍵詞：高糖誘導髓核細胞凋亡的相關研究

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【摘要】：研究背景及目的:細胞凋亡參存在于機體的整個生命過程,參與了生命過程中的各種生理及病理過程。細胞凋亡的增加或者減少是許多疾病的發(fā)病基礎。目前研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)除了參與機體正常的生命活動,也參與了細胞的凋亡過程,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑成為新的凋亡通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的主要機制是各種理化因素導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細胞生命過程中發(fā)揮重要作用,其主要功能是參與蛋白質(zhì)的折疊、修飾及合成。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到內(nèi)外理化因素刺激時,會導致蛋白質(zhì)的代謝及合成障礙。當理化因素強烈、持續(xù)存在時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)紊亂,積累大量的未折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)后,會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑,進而導致細胞凋亡。當椎間盤髓核組織中髓核細胞大量凋亡時,即可引起椎間盤退變,進而導致一些列脊椎退行性疾病的發(fā)生。本研究旨在通將髓核細胞培養(yǎng)于含有高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中,探討在高糖環(huán)境中,ERS是否參與誘導兔髓核細胞的凋亡過程。方法:本實驗采用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化法,體外分離、培養(yǎng)兔髓核細胞,經(jīng)過甲苯胺藍染色、蘇木精-伊紅染色后觀察細胞形態(tài)。通過細胞免疫組織化學染色、免疫熒光染色鑒定髓核細胞后,將第三代兔髓核細胞隨機分為四組,包括:對照組(正常培養(yǎng)基組)、高糖組(培養(yǎng)基中含有100m M葡萄糖)、Caspase-12抑制劑組(培養(yǎng)基中含有2μM氟甲基酮)和高糖+Caspase-12抑制劑組(培養(yǎng)基中含有2μM氟甲基酮及100m M葡萄糖),每組細胞按照不同的實驗條件處理6h后,分別采用CCK-8試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒檢測各組細胞的增殖活性及凋亡情況,ROS檢測試劑盒檢測各組細胞內(nèi)的總活性氧(reactive oxygen species,ROS),PCR和Western-blot檢測各組Caspase-12和Grp78的表達變化。結果:成功完成了兔髓核細胞的體外分離培養(yǎng);髓核細胞染色后鏡下觀察呈多角形、短梭形,有一到兩個核仁,隨著傳代次數(shù)增加,細胞伸出偽足,胞體逐漸變細長;體外分離培養(yǎng)髓核細胞可穩(wěn)定表達Ⅱ型膠原蛋白。高糖組細胞增殖活性明顯受抑制,細胞內(nèi)ROS及凋亡率明顯增加,Caspase-12和Grp78表達量較對照組明顯增加;氟甲基酮可以降低高糖誘導的細胞凋亡率、Caspase-12及Grp78的表達。結論:1.ERS通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Caspase-12凋亡通路參與了高糖誘導髓核細胞凋亡的過程;2.高糖誘導的ROS過量產(chǎn)生及積累是引起ERS的主要因素之一。
【關鍵詞】：細胞凋亡 ERS Caspase-12 Grp78
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R681.5
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第1章 實驗材料和方法9-19
• 1.1 材料9-10
• 1.1.1 實驗動物9
• 1.1.2 實驗試劑9-10
• 1.1.3 實驗儀器10
• 1.2 實驗方法10-19
• 1.2.1 兔髓核細胞體外分離培養(yǎng)10-11
• 1.2.2 制備細胞爬片11
• 1.2.3 髓核細胞鑒定11-12
• 1.2.3.1 髓核細胞的形態(tài)學觀察11
• 1.2.3.2 髓核細胞蘇木精-伊紅染色11
• 1.2.3.3 髓核細胞甲苯胺藍染色11
• 1.2.3.4 髓核細胞免疫組織化學染色11-12
• 1.2.3.5 髓核細胞免疫熒光染色12
• 1.2.4 實驗分組12
• 1.2.5 細胞增殖活性檢測12-13
• 1.2.6 細胞內(nèi)總ROS檢測13
• 1.2.7 細胞凋亡率檢測13
• 1.2.8 熒光定量PCR檢測Caspase-12和Grp78基因表達13-15
• 1.2.8.1 引物的合成13-14
• 1.2.8.2 Trizol法提取細胞總RNA14
• 1.2.8.3 應用Prime Script TM RT reagent Kit進行逆轉錄14
• 1.2.8.4 應用Light Cycler?480 System Real Time PCR擴增儀分析目的基因的表達14-15
• 1.2.9 蛋白印跡分析15-17
• 1.2.9.1 細胞總蛋白的提取15-16
• 1.2.9.2 蛋白濃度測定16
• 1.2.9.3 凝膠電泳16-17
• 1.2.9.4 轉膜17
• 1.2.9.5 孵育抗體17
• 1.2.9.6 顯影17
• 1.2.10 統(tǒng)計學分析17-19
• 第2章 實驗結果19-28
• 2.1 兔髓核細胞體外分離培養(yǎng)結果19-20
• 2.2 兔髓核細胞鑒定結果20
• 2.3 細胞增殖活性檢測結果20-22
• 2.3.1 各組髓核細胞吸光光度值（OD 值）見表 1.121
• 2.3.2 各組髓核細胞用不同培養(yǎng)基培養(yǎng) 6h 后，經(jīng) CCK-8 Kit 檢測各組髓核細胞增殖活性見表 1.221-22
• 2.4 細胞內(nèi)總ROS檢測結果22-23
• 2.5 細胞凋亡率檢測23-25
• 2.6 RT-PCT檢測各組細胞Caspase-12和Grp78基因表達結果25-26
• 2.7 Western-blot檢測各組細胞Caspase-12和Grp78表達結果26-28
• 第3章 討論28-32
• 第4章 結論32-33
• 參考文獻33-36
• 文獻綜述36-43
• 綜述參考獻41-43
• 攻讀學位期間的研究成果43-44
• 致謝44-45

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李忠生;于常艷;陳宵;張斌;曹鵬;李斌;肖經(jīng)緯;;喹乙醇致腎臟毒性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡途徑研究[J];衛(wèi)生研究;2015年03期

2 于占革;楊威;溫瑩;徐學振;魏偉;李念龍;;兔不同節(jié)段椎間盤髓核細胞培養(yǎng)特性的比較[J];中國脊柱脊髓雜志;2010年08期

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本文編號：864349